Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.
Birkaç yıl önce, insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) kurulması biyomedikal yeni bir dönem başlatmıştır. Insan iPSCs potansiyel kullanımları, insan genetik hastalıklarının modellenmesi patogenezi, gen düzeltme sonrası otolog hücre tedavisi ve hastaya özgü ve belirti gerekli hücrelerin bir kaynağı sağlayarak kişiselleştirilmiş ilaç tarama içerir. Ancak, bu tür bir insan iPSCs üretim sonrası kalan yeniden programlama faktörü transgen ekspresyonunu ortadan kaldırarak üstesinden gelmek için çok engel vardır. Daha da önemlisi, farklılaşmamış insan iPSCs kalıntı transgen ifadesi doğru farklılaşmaları engel ve hastalıktan ilgili vitro fenotiplerinde yorumunu şaşırtıp-saptırırlar olabilir. Bu neden ile, entegrasyon içermeyen ve / veya transgen içermeyen insan iPSCs adenovirüs, piggyBac sistemi minicircle vektör epizomal vektörler, direkt protein temini gibi çeşitli yöntemler kullanılarak geliştirilmiş ve mRNA sentezlenmiştir. Bununla birlikte, reprogra etkinliğientegrasyon-ücretsiz yöntemlerle features çoğu durumda oldukça düşüktür.
Burada, Sendai-virüsü (RNA virüsü) tabanlı yeniden programlama sistemi kullanarak insan iPSCs izole etmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, yeniden programlama tutarlı sonuçlar ve düşük maliyetli bir şekilde yüksek bir verimlilik göstermektedir.
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) ilaç taraması için, hastalık modelleme için potansiyel olarak yararlı olabilir ve hastalık ve doku yaralanmaları tedavi etmek için hücre tabanlı tedaviler geliştirmek için kendini yenilemek in vitro ve sahip pluripotensin bir kapasiteye sahip. Ancak, HESC çünkü, immünolojik onkolojik ve etik engellerin hücre replasman tedavisi için bir sınırlama var, ve hastalık ile ilgili genlerin çalışma, hastalığa özgü HESC pre-implantasyon genetik tanı (PGD) yaklaşımları ile izole edilebilir, ama yine de teknik açıdan zor ve embriyo bağışlar oldukça nadirdir. Bu sorunlar, uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gelişmesine yol açmıştır kök hücre biyolojisi, ilerleme ile ilgilidir.
İnsan iPSCs genetik yetişkin insan somatik hücrelerinden yeniden programlanan ve onları böyle d gibi rejeneratif tıp için yararlı bir kaynak yapar HESC benzer pluripotent kök hücre benzeri özellikler, liman vardırhalı keşif, hastalık modelleme ve hastaya özgü şekilde 1,2 hücre tedavisi.
Bugüne kadar, virüs aracılı (retrovirüs ve adenovirüs) dahil olmak üzere insan iPSCs oluşturmak için çeşitli yöntemler, 3, non-virüs aracılı (BAC sistemi ve vektörler transfeksiyon) 4 gen transdüksiyon ve protein dağıtım sistemi 5-7 vardır.
Virüs-aracılı gen iletim verimliliği belirli bir düzeyde olmak, ancak bunlar, kontrolsüz bir şekilde yeniden programlama genleri ifade etmek için bir ev sahibi kromozomları içine entegre, çünkü viral vektörler, genetik iz bırakabilir. Transkripsiyon faktörlerinin viral entegrasyonu etkinleştirmek veya konak genleri 8 inaktive olabilir bile, bu beklenmedik bir genetik sapma ve tümörgenez 5,9 riskini neden olabilir. Öte yandan, somatik hücrelere protein veya RNA doğrudan katılması bildirilmiştir, ancak bu emek-yoğun, tekrarlı transf gibi bazı dezavantajları vardır edildiection ve 7,10 yeniden programlama düşük seviyesi. Hatta epizomal olmayan entegre adenovirüs, adeno-bağlantılı virüs, ve plasmid vektörler yine 11 göreli olarak daha az verimlidir. Bu nedenlerden dolayı, iPSC nesil yüksek etkinlik ve daha az genetik anormallikler olmayan entegrasyon yeniden programlama yöntemlerini seçmek için makul. Bu çalışmada, bir-Sendai virüs esasına dayalı yeniden programlama kullanın. Bu yöntem, konakçı genomuna entegre olmayan ve tutarlı bir şekilde, transgen entegrasyon olmadan insan iPSCs üreten olduğu bilinmektedir.
HiPSCs insan somatik hücreleri yeniden programlama temel biyoloji, kişisel tıp ve transplantasyon 12 görülmemiş sözleri tutar. Daha önce, insan iPSC nesiller gibi ilaç geliştirme ve nakli tedavileri 13 gibi diğer klinik uygulamaları sınırlandıran istenmeyen genetik mutasyonlar oluşturabilir konakçı genomu içine entegrasyon riski DNA virüsü gereklidir. Bu nedenle birlikte, birçok çalışmada çeşitli alternatif yöntemlerle vektör ve transgen-free sistemi, insan iPSCs oluşt…
The authors have nothing to disclose.
Biz el yazması değerli tartışmalar için Lee laboratuar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Lee laboratuarda çalışma Hücre Araştırma Fonu (Tedco) Kök New York Kök Hücre Vakfı Robertson Araştırmacı Ödülü ve Maryland hibe tarafından desteklenmiştir.
CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
Trizol | invitrogen | 15596018 | |
picking hood | NuAire | NU-301 | |
dissecting scope | Nikon | SMZ745 |