כאן, אנו מציגים שיטה הוקמה לתכנת מחדש תאים סומטיים אנושיים לiPSCs אדם נטול transgene בוירוס סנדאי, אשר מראה תוצאות עקביות ויעילות משופרת.
לפני כמה שנים, הקמת התאים האנושיים מושרה גזע pluripotent (iPSCs) הובילה עידן חדש ביו. שימושים פוטנציאליים של iPSCs אדם כוללים פתוגנזה מודלים של מחלות גנטיות אנושיות, טיפול בתאים עצמיים לאחר תיקון הגן, והקרנת תרופה מותאמת אישית על ידי מתן מקור של תאים רלוונטיים מטופל ספציפי וסימפטום. עם זאת, ישנם מספר מכשולים להתגבר, כגון ביטול ביטוי transgene גורם תכנות מחדש שנותר לאחר ייצור iPSCs האדם. חשוב מכך, ביטוי transgene שייר בiPSCs אדם שלא עברו התמיינות יכול לעכב בידול נכון ולהטעות את הפרשנות של מחלה רלוונטית בפנוטיפים מבחנה. עם מסיבה זו, ללא אינטגרציה ו / או iPSCs אדם נטול transgene פותחו באמצעות מספר שיטות, כגון אדנווירוס, מערכת piggyBac, וקטור minicircle, וקטורי episomal, אספקת חלבון ישירה ומסונתזת ה-mRNA. עם זאת, יעילות של reprogramming תוך שימוש בשיטות ללא אינטגרציה הוא נמוך למדי ברוב המקרים.
כאן, אנו מציגים שיטה לבודד iPSCs אדם באמצעות סנדאי וירוס מערכת מבוססת תכנות מחדש (וירוס RNA). שיטת תכנות מחדש זה מראה תוצאות עקביות ויעילות גבוהה באופן חסכוני.
תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) יש יכולת pluripotency העצמי לחדש במבחנה ויש לי, שיכול להיות שעשוי להיות שימושי עבור מודלים מחלה, להקרנת סמים, ולפתח טיפולים מבוססי תאים לטיפול בפציעות מחלות ורקמות. עם זאת, יש לי hESCs הגבלה לטיפול בתחליפי תא בגלל מחסומים חיסוניים, אונקולוגי ואתיים, וללמוד גנים הקשורים למחלות, יכול להיות מבודד hESCs ספציפי למחלה באמצעות אבחון גנטי טרום השרשה (PGD) מתקרב, אבל זה עדיין מאתגר מבחינה טכנית ותרומות העובר הן די נדירות. סוגיות אלה קשורות להתקדמות בביולוגיה של תאי גזע, מה שהוביל להתפתחותם של תאים מושרה pluripotent גזע (hiPSCs).
iPSCs האנושי לתכנות מחדש מבחינה גנטית מתאי סומטיים מבוגר אנושיים ונמל תכונות גזע pluripotent דמוי תא דומה לhESCs, מה שהופך אותם למקור שימושי עבור רפואת רגנרטיבית כגון דגילוי שטיח, דוגמנות מחלה וטיפול בתאים ב1,2 אופן ספציפי למטופל.
עד עכשיו, יש כמה 3, מערכת אספקת חלבון 5-7 (מערכת BAC וtransfection וקטורים) שאינו וירוס בתיווך 4 transductions גן, ושיטות ליצירת iPSCs אדם, לרבות בתיווך וירוסים (רטרווירוס וadenovirus).
למרות שמשלוח של גנים בתיווך וירוס יכול להבטיח רמה מסוימת של יעילות, וקטורים ויראליים יכולים להשאיר טביעת רגל גנטית, כי הם להשתלב בכרומוזומים מארח לבטא גנים תכנות מחדש באופן בלתי מבוקר. גם כאשר אינטגרציה נגיפית של גורמי שעתוק יכולה להפעיל או להשבית גנים מארח 8, זה יכול לגרום לסטייה גנטית בלתי צפויה ואת הסיכון להיווצרות גידול ב5,9. מצד השני, ההקדמה הישירה של חלבונים או RNA לתאים סומטיים דווחו, אבל יש כמה חסרונות כגון transf עתיר עבודה, חוזר ונשנהection, ורמה הנמוכה של תכנות מחדש של 7,10. וקטורי adenovirus אפילו episomal ולא שילוב, וירוס adeno הקשורים, ופלסמיד עדיין יחסית פחות יעילים 11. מסיבות אלה, סביר לבחור שיטות תכנות מחדש ללא שילוב עם יעילות גבוהה של דור iPSC ומומים גנטיים פחות. במחקר זה, אנו משתמשים בתכנות מחדש המבוסס סנדאי וירוס. שיטה זו ידועה להיות שאינה משתלב בגנום המארח ובעקביות מייצרת iPSCs האנושי ללא אינטגרציות transgene.
תכנות מחדש של תאים סומטיים אדם לhiPSCs מחזיק הבטחות חסרות תקדים בביולוגיה בסיסית, תרופות אישיות, והשתלה 12. בעבר, דורות iPSC אדם הנדרשים וירוס ה-DNA כי יש סיכון אינטגרציה לתוך הגנום המארח, אשר יכול ליצור מוטציות גנטיות לא רצויות המגבילות את יישומים קליניים נוספים כגון ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).
CytoTune-iPS Reprogramming Kit | invitrogen | A1378002 | |
CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated | Global stem | GSC-6105M | 5X105/6cm or 12.5X105/24 well plate |
Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X | invitrogen | 25200114 | |
DMEM/F-12 medium | invitrogen | 11330-032 | |
24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD | 353935 | |
Y-27632 | TOCRIS | 1254 | 10 uM (Stock: 10 mM) |
basic fibroblast growth factor | LIFE TECHNOLOGIES | PHG0263 | 10 ng (Stock : 100 ug) |
Knock-out serum replacement | Gibco | 10828028 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose) | invitrogen | 11965118 | |
Fetal bovine serum | Thermo Scientific Fermentas | SH30071.03 | |
L-Glutamine-200 mM (100X), liquid | GIBCO | 25030-081 | 1/100 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X | LIFE TECHNOLOGIES | 11140050 | 1/100 |
2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | GIBCO | 21985023 | 1/1000 |
Hausser Phase Contrast Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | |
SSEA-4 | DSHB | MC-813-70 | 1/200 |
anti-Tra-1-81 | cell signaling | 4745S | 1/200 |
mouse monoclonal Oct4 antibody | Santa Cruz | SC-5279 | 1/1000 |
Nanog | R&D | AF1997 | 1/1000 |
Alexa Flouor 488 goat anti-mouse | invitrogen | 948492 | 1/2000 |
DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium & magnesium | cellgro | 21-031-CV | |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205313 | |
PCR Master Mix [2X] | Thermo Scientific Fermentas | K0171 | |
Trizol | invitrogen | 15596018 | |
picking hood | NuAire | NU-301 | |
dissecting scope | Nikon | SMZ745 |