כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon ספן מיני himar1 ליצירת ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה למסך, לבודד ולזהות רגולטורים אלגינט רומן בPAO1 מתח Pseudomonas aeruginosa אב הטיפוס.
Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק גראם שלילי, סביבתי עם יכולות מטבוליות צדדי. פ aeruginosa הוא פתוגן חיידקים אופורטוניסטי הקובע דלקות ריאה כרוניות בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF). ייצור יתר של פוליסכריד קופסית נקרא אלגינט, הידוע גם mucoidy, מקדם את הקמתה של biofilms רירני שהם עמידים יותר מאשר תאי פלנקטון לכימותרפיה אנטיביוטיקה והגנה מארחת. בנוסף, ההמרה מnonmucoid לפנוטיפ רירני היא סמן קליני לתחילתה של דלקת כרונית בCF. ייצור יתר אלגינט על ידי פ ' aeruginosa הוא תהליך endergonic מיסי אנרגיה בתאים כבד. לכן, ייצור אלגינט מוסדר מאוד בפ aeruginosa. כדי להבין טוב יותר רגולציה אלגינט, אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis transposon מיני himar1 לזיהוי רגולטור אלגינט רומןים בPAO1 זן אב טיפוס. ההליך מורכב משני שלבים בסיסיים. ראשית, העברנו את transposon מיני himar1 (pFAC) מהמארח א coli SM10/λpir לנמען P. aeruginosa PAO1 באמצעות נטיית biparental ליצור ספריית מוטציה הכנסה בצפיפות גבוהה, אשר נבחרו על צלחות אגר בידוד Pseudomonas בתוספת gentamycin. שנית, אנו הוקרנו ובודדנו את מושבות רירני למפה אתר ההחדרה באמצעות PCR ההפוך באמצעות פריימרים DNA מצביעים החוצה מקלטת gentamycin ורצפי DNA. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו שני רגולטורים רומן אלגינט, mucE (PA4033) וkinB (PA5484), בPAO1 מתח עם mucA פראי מסוג קידוד הגורם אנטי סיגמא MucA לרגולטור אלגינט מאסטר AlgU (AlgT, σ 22) . פרוטוקול mutagenesis תפוקה גבוהה זה יכול להיות שונה לזיהוי גנים הקשורים לאלימות אחרים הגורם לשינוי בקולומורפולוגיה ניו יורק.
היכולת של האופורטוניסטי, הפתוגן גראם השלילי Pseudomonas aeruginosa לoverproduce אלגינט היא גורם מרכזי ביכולתה להקים biofilm. ייצור יתר של אלגינט הוא הפנוטיפ המכונה לעתים קרובות כmucoidy. הבידוד של מושבות רירני מספוטה של אנשים לוקים בסיסטיק פיברוזיס (CF) הוא מעיד על זיהום כרוני, והיא קשור באופן ישיר עם ירידה כללית בבריאותו של החולה 1. נכון לעכשיו, הוא הבין כי הרגולציה וייצור של אלגינט בפ aeruginosa מתרחש בעיקר בשני operons. הראשון הוא אופרון biosynthetic אלגינט, המכיל 12 גנים (algD – alg8 – alg44 – algK – alge – algG – algX – algL – algI – algJ – algF – אצה) שאחראים לסינתזה והיצוא של פולימר אלגינט פני periplasm לenvironme תאיNT 2-5. אופרון השני הוא אשכול גנים החל עם גורם סיגמא האלטרנטיבי algU / T וממשיך בmucA, mucB, וmucD. AlgU / T הוא רגולטור חיובי, בעוד mucAB-D מסווגים כרגולטורים שליליים של ייצור אלגינט 6-8. בנוסף, רגולטורים תעתיק, כגון AlgB, AlgQ, AlgR, וRpoN, כמו גם לאחר תעתיק ושינוי שלאחר translational על ידי שליטת catabolite דיכוי, פעילות קינאז (KinB) וproteolysis intramembrane, יש גם הוכחו להיות מעורבים באלגינט הרגולציה 9-14.
וקטור transposon מיני himar1 המכונה pFAC נוצר במקור במעבדה של ד"ר Mekalanos בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד 15. פלסמיד pFAC מורכב מאלמנט transposable המוקף שתי חזרות הפוכות של 27 bps וקלטת gentamycin התנגדות באמצע (aacC1: 534 נ"ב), גן מקודד hyperactive transposase ספן 16, וβ-lactamase גן קידוד (בלה) (איור 1). מידע רצף עבור אלמנט transposable של pFAC זמין במספר הצטרפות GenBank: 13 DQ366300. בpFAC, יש אתר שיבוט מרובה (MCS) מאחורי גן aacC1 המשמש לזיהוי של אתר ההכנסה כרומוזומליות באמצעות PCR ההפוך. אחד יתרונות גדולים בשימוש בtransposon מיני himar1 אין גורמי מארח ספציפיים נדרשים לטרנספוזיציה (mutagenesis). בנוסף, יש שפע גבוה של החדרת אתרי dinucleotide ת"א נמצאים בכל הגנום של פ aeruginosa. לדוגמא, אתרי החדרת dinucleotide ת"א מתרחש 94,404 ו100,229 פעמים בPAO1 (6,264,404 bps, מספר הצטרפות GenBank NC_002516.2) וPA14 (6,537,648 bps; מספר גישת GenBank NC_008463) הגנום, בהתאמה. בגלל השפע של dinucleotide ת"א בגנום, מיני himar1 </em> Transposon יכול לגרום לצפיפות גבוהה וmutagenesis האקראי, שהוא מתאים במיוחד לניתוח של גנים ארסיות והגנים שקבועים בתקנות. באופן תיאורטי, transposon מיני himar1 יכול להכניס לתוך כל גן חיוני בתוך הגנום של פ aeruginosa. זה מספק כ 18 אתרי החדרה ת"א לכל מסגרת קריאה פתוחה בגנום PAO1.
כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות mutagenesis בתיווך transposon מיני himar1 לזהות רגולטורים רומן של mucoidy בפ aeruginosa. באופן ספציפי יותר, אנו biparentally מצומדת וקטור pFAC מכיל transposon מיני himar1 מE. coli SM10/λpir לPAO1 מתח prototrophic nonmucoid. לאחר transposon משולב בגנום, מתח הנמען הוא תרבית על אגר בידוד Pseudomonas טריקלוזן (PIA) המכיל אשר מעכב את הצמיחה של E. coli. לפיכך, ספרייה של מוטציות של <em> פ ניתן לבחור aeruginosa על ידי הגידול בצלחת PIA בתוספת gentamycin ואת הנוכחות של פנוטיפ רירני. שים לב, לעומת מוטציה אינטגרציה בתיווך transposon יהיה אמיתי הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. במחקר זה, כ -80,000 מוטציות החדרת PAO1 היו מבודדות באמצעות ארבעה פעלים נפרדים. אנחנו מכן הוקרנו מבודדים רירני, וקבענו את האתר של הכנסה על ידי עיכול אנזים הגבלה, קשירה והפוכה ה-PCR. ביצענו ניתוח כתם דרום באמצעות קלטת התנגדות gentamycin כמו בדיקה כדי לראות את המספר של החדרה לגנום. אנחנו קבענו כי יותר מ 90% ממוטציות שהושגו לנטיית שימוש בפרוטוקול זה היה עותק אחד בלבד של himar1 בגנום ומוצגים הפנוטיפ עמיד וcarbenicillin רגיש gentamycin. כולל של 32 מבודדים רירני זוהו, 22 שלהם מופו ללוקוסים של פ שונים aeruginosa PAO1כרומוזום. שיעור זה של הכנסה מספק כיסוי הולם לזהות כמה רגולטורים רומן של ייצור יתר אלגינט.
חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש במינים Pseudomonas אחרים עם השינויים הבאים: דגירה פ fluorescens ו פ putida ב30 מעלות צלזיוס, ופ stutzeri על 42 מעלות צלזיוס; פ stuzeri צריך להיות מתורבת על צלחות LB בתוספת 150 מיקרוגרם / מ"ל של gentamycin; על צעד 1.11, פ תאי stutzeri צריכ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית לאווירונאוטיקה וחלל מנהל מערב וירג'יניה שטח גרנט Consortium (נאס"א WVSGC), קרן סיסטיק פיברוזיס (CFF-YU11G0) ו-NIH P20RR016477 וP20GM103434 לרשת רעיון המערב וירג'יניה ביו רפואית מצוינות מחקר. אנו מודים Vonya מ 'אייזינגר לסיוע הטכני בעבודה זו.
Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |