Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.
Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve, milieu-bacterie met veelzijdige metabolische mogelijkheden. P. aeruginosa is een opportunistische bacteriële pathogenen die chronische longinfecties bij patiënten met cystische fibrose (CF) stelt. De overproductie van een capsulair polysaccharide genoemd alginaat, ook wel mucoidy, bevordert de vorming van slijmerige biofilms die resistenter dan plankton cellen antibiotische chemotherapie en het afweersysteem zijn. Bovendien, de conversie van de nonmucoid tot mucoïde fenotype is een klinische merker voor het ontstaan van chronische infectie bij CF. Alginaat overproductie door P. aeruginosa is een endergonic proces dat zwaar belast cellulaire energie. Daarom wordt alginaat productie sterk gereguleerd in P. aeruginosa. Om beter te begrijpen alginaat regelgeving, een protocol beschrijven we het gebruik van de mini-himar1 transposon mutagenese voor de identificatie van nieuwe alginaat regulators in een prototype stam PAO1. De procedure bestaat uit twee fasen. Eerst hebben we overgedragen de mini-himar1 transposon (PFAC) van gastheer E. coli SM10/λpir in ontvangende P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugatie een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek, die werden geselecteerd op Pseudomonas isolatie agarplaten aangevuld met gentamycine maken. Ten tweede hebben we afgeschermd en geïsoleerd van de slijmerige kolonies op de plaats van inbrengen in kaart door middel van omgekeerde PCR met behulp van DNA-primers naar buiten wijzende uit de gentamycine cassette en DNA-sequencing. Met behulp van dit protocol, hebben we twee nieuwe alginaat regulatoren, MUCE (PA4033) en kinB (PA5484), in stam PAO1 met een wild-type muca codeert voor het anti-sigmafactor muca voor de master alginaat regulator AlgU geïdentificeerd (ALGT, σ 22) . Deze hoog-mutagenese protocol kan worden aangepast voor het identificeren van andere virulentie genen veroorzaken veranderingen in colony morfologie.
Het vermogen van de opportunistische, Gram-negatieve pathogeen Pseudomonas aeruginosa te alginaat overproductie is een belangrijke factor in het vermogen om een biofilm stellen. De overproductie van alginaat is een fenotype vaak aangeduid als mucoidy. De isolatie van slijmerige kolonies van de sputa van personen die lijden aan cystische fibrosis (CF) is een indicatie van een chronische infectie, en is rechtstreeks verbonden met een algemene daling van de gezondheid van de patiënt 1. Momenteel wordt ervan uitgegaan dat de verordening en de productie van alginaat in P. aeruginosa treedt vooral op bij twee operons. De eerste is het alginaat biosynthetische operon, die 12 genen bevat (algD – alg8 – alg44 – algK – Alge – algG – Algx – algL – Algi – algJ – algF – Alga) dat verantwoordelijk is voor de synthese en de uitvoer van het alginaat polymeer over zijn het periplasma aan het extracellulaire environment 2-5. De tweede operon is een cluster van genen te beginnen met de alternatieve sigma factor algU / T en verder met muca, mucB en mucD. AlgU / T is een positieve regulator, terwijl mucAB-D worden geclassificeerd als negatieve regulatoren van alginaat productie 6-8. Bovendien, transcriptiefactoren, zoals ALGB, AlgQ, ALGr en RpoN, alsmede post-transcriptionele en post-translationele modificatie van katabolische repressie controle kinaseactiviteit (KinB) en intramembrane proteolyse, zijn ook getoond betrokken te zijn bij alginaat regelgeving 9-14.
De mini-himar1 transposon vector bekend als PFAC werd oorspronkelijk opgericht in Dr Mekalanos 'laboratorium aan de Harvard Medical School 15. De PFAC plasmide bestaat uit een transposon geflankeerd door twee omgekeerde herhalingen van 27 bp en een weerstand tegen gentamycine cassette in het midden (aacC1: 534 bp), een gen coderend voor het hyperactive mariner transposase 16, en een gen dat codeert voor β-lactamase (bla) (figuur 1). Sequentie-informatie voor de transposon van PFAC is verkrijgbaar bij de GenBank: DQ366300 13. In PFAC er een meervoudige kloneringsplaats (MCS) dat de aacC1 gen dat wordt gebruikt voor de identificatie van chromosomale insertieplaats middels omgekeerde PCR. Een groot voordeel met behulp van de mini-himar1 transposon is geen specifieke gastheer factoren zijn nodig voor de omzetting (mutagenese). Daarnaast is er een grote dichtheid aan de TA dinucleotide insertieplaatsen gevonden in het genoom van P. aeruginosa. Bijvoorbeeld, TA dinucleotide insertieplaatsen optreedt 94.404 en 100.229 keer in de PAO1 (6.264.404 bps, GenBank NC_002516.2) en PA14 (6.537.648 bps; GenBank toegangsnummer NC_008463) genomen, respectievelijk. Vanwege de overvloed van TA dinucleotide in het genoom, mini-himar1 </em> Transposon kan hoge dichtheid en willekeurige mutagenese, die bijzonder geschikt voor de analyse van virulentie genen en genen die sterk gereguleerd veroorzaken. Theoretisch kan de mini-himar1 transposon te voegen in elke niet-essentieel gen in het genoom van P. aeruginosa. Dit levert ongeveer 18 TA insertieplaatsen per open reading frame in de PAO1 genoom.
Hier, een protocol beschrijven we het gebruik van mini-himar1-transposon mutagenese om nieuwe regulatoren van mucoidy in P. identificeren aeruginosa. Meer specifiek, we biparentally geconjugeerd de PFAC vector die een mini-himar1 transposon van E. coli SM10/λpir in de nonmucoid prototrofe stam PAO1. Nadat de transposon is geïntegreerd in het genoom, de ontvangende stam wordt gekweekt op Pseudomonas isolatie agar (PIA) die triclosan die de groei van E. remt coli. Zo een bibliotheek van mutanten van <em> P. aeruginosa kan de groei geselecteerd op PIA plaat aangevuld met gentamycine en de aanwezigheid van de mucoïde fenotype. Let op, een echte transposon-gemedieerde versus een integratie mutant zal een gentamycine resistent en carbenicilline-gevoelige fenotype hebben. In deze studie werden ongeveer 80.000 insertiemutanten van PAO1 geïsoleerd door middel van vier afzonderlijke vervoegingen. We vervolgens gescreend op mucoïde isolaten, en bepaalde de plaats van invoeging door restrictie-enzym digestie, ligatie en omgekeerde PCR. We voerden Southern blot analyse met behulp van weerstand tegen gentamycine cassette als een probe voor het aantal insertie per genoom bekijken. We hebben vastgesteld dat meer dan 90% van mutanten verkregen per conjugatie met dit protocol had slechts een enkele kopie van het himar1 in het genoom en de weergegeven gentamycine resistente en carbenicilline-gevoelige fenotype. Een totaal van 32 mucoïd isolaten werden geïdentificeerd, 22 van hen werden toegewezen aan verschillende loci van de P. aeruginosa PAO1chromosoom. Dit tarief van inbrengen biedt voldoende dekking om verschillende nieuwe regulatoren van alginaat overproductie identificeren.
Het is belangrijk op te merken dat deze methode kan worden gebruikt in andere Pseudomonas species met deze aanpassingen: incuberen P. fluorescens en P. putida bij 30 ° C en P. stutzeri bij 42 ° C; P. stuzeri worden gekweekt op LB-platen gesupplementeerd met 150 ug / ml gentamycine, in stap 1.11, blz. stutzeri cellen worden overgebracht in 500 ui LB plaats van 1 ml. Daarnaast zijn er twee belangrijke stappen voor dit protocol. Ten eerste moet de ontvangende stam gek…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de National Aeronautics and Space Administration West Virginia Space Grant Consortium (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) en NIH P20RR016477 en P20GM103434 aan de West Virginia IDeA Network for Biomedical Research Excellence. Wij danken Vonya M. Eisinger voor de technische ondersteuning bij dit werk.
Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |