Endothelzellen Schlauchbildung Assay für die<em> In-vitro-</em> Studium der Angiogenese
Summary
Das Rohr-Assay ist eine schnelle, quantifizierbare Verfahren zum Messen in vitro Angiogenese. Endothelzellen werden mit konditioniertem Medium kombiniert und Basalmembran-Extrakt ausgestrichen. Schlauchbildung erfolgt innerhalb von Stunden und neu gebildeten Tubuli leicht quantifizieren.
Abstract
Angiogenese ist ein wichtiger Prozess für normale Gewebeentwicklung und der Wundheilung, aber auch mit einer Vielzahl von pathologischen Zuständen verbunden sind. Über dieses Protokoll kann die Angiogenese in vitro in einem schnellen, messbaren Weise gemessen werden. Primäre oder immortalisierte Endothelzellen mit konditioniertem Medium vermischt und auf Basalmembranmatrix plattiert. Die Endothelzellen bilden Kapillare artigen Strukturen in Abhängigkeit von angiogenen Signale in konditioniertem Medium gefunden. Das Rohr Bildung erfolgt schnell mit Endothelzellen beginnen, sich innerhalb von 1 Stunde und Lumen-haltigen Tubuli beginnen, innerhalb von 2 h erscheinen auszurichten. Rohre können mit einem Phasenkontrastmikroskop sichtbar invertiert werden, oder die Zellen können mit Calcein AM vor dem Assay und Rohre, durch Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie sichtbar behandelt werden. Die Anzahl der Verzweigungsstellen / Knoten, Schlaufen / Maschen, oder die Anzahl oder Länge der Rohre gebildet wird, leicht als ein Maß der in vitr quantifiziert werdeno Angiogenese. Zusammenfassend kann dieser Assay verwendet werden, um Gene und Signalwege, die für die Förderung oder Hemmung von Angiogenese in einem schnelle, reproduzierbare und quantitative Weise beteiligt sind, zu identifizieren.
Introduction
Angiogenese, die Bildung neuer Blutgefäße aus bereits existierenden Schiffen, ist von entscheidender Bedeutung für eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Organwachstum, Embryonalentwicklung, Wundheilung und 1-3. Neu entwickelten Blutgefäße, durch Endothelzellen, Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen zu den Geweben ausgekleidet, die Förderung der Immunüberwachung von hämatopoetischen Zellen und entfernen Abfallprodukte 2,4. Angiogenese ist von zentraler Bedeutung während der embryonalen und fetalen Entwicklung. Allerdings ist dieses Verfahren ruhend im erwachsenen außer während Zeiten der Wundheilung, Knochenwachstums, Schwangerschaft oder während des Menstruationszyklus 1-3.
In den letzten zwei Jahrzehnten, Schlüssel molekularen Mechanismen, die Angiogenese zu regulieren haben begonnen, zu entstehen. Die Angiogenese ist ein streng regulierter Veranstaltung, die von pro und anti-angiogenen Signale einschließlich Integrine, Chemokine, Angiopoietine, Sauerstofferfassungsmittel, Junction-Moleküle und endogenen Inhibitoren 5 ausgeglichen. Sobald proangiogenic Signale, wie basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Rezeptoren aktivieren die Endothelzellen Endothelzellen frei Proteasen an der Basalmembran abzubauen. Die Endothelzellen proliferieren und wandern dann bilden Sprossen mit einer Geschwindigkeit von einigen Millimetern pro Tag 6,7.
Angiogenese ist mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich Krebs, Psoriasis, diabetische Retinopathie, Arthritis, Asthma, Autoimmunerkrankungen, Infektionskrankheiten und Atherosklerose 8-10 zugeordnet. Wegen der Bedeutung der Angiogenese bei verschiedenen Krankheiten, Analyse von Genen und Signalwege, die zu regulieren Dieses Verfahren ist für die Entwicklung besserer Therapeutika.
Das Rohr-Assay ist eine schnelle und quantitative Verfahren zur Bestimmung von Genen oder Wege in der Angiogenese beteiligt. 1988 erstmals beschrieben,die Grundsätze dieses Tests zugrunde liegen, dass Endothelzellen die Fähigkeit sich zu teilen und zu migrieren rasch in Reaktion auf angiogenen Signale 11-13 behalten. Ferner sind Endothelzellen induziert, um zu differenzieren, und bilden röhrenförmige Strukturen, wenn sie auf einer Matrix von Basalmembran-Extrakt (BME) kultiviert. Diese Röhrchen enthalten ein Lumen von Endothelzellen zusammen durch junktionale Komplexe verknüpft umgeben. Schlauchbildung erfolgt schnell mit den meisten Röhren bilden in diesem Test innerhalb von 2-6 Stunden, je nach Menge und Art der angiogenen Stimuli.
Mehrere Arten von Endothelzellen kann für diesen Assay sowohl primäre Zellen und immortalisierten Zelllinien 14,15 verwendet werden. Die Zelllinie für diesen Artikel war Maus 3B-11, aber die gleiche Methodik kann mit anderen Endothel-Zelllinien, wie SVEC4-10 (Maus) oder primären Endothelzellen wie HUVEC (menschliche) Zellen angewandt werden. Je nachdem, welcher Zelllinie verwendet wird, und ob der endothelialen cells umgewandelt oder nicht transformierten, wird Optimierung müssen durchgeführt, um den idealen Zeitpunkt für die richtige Schlauchbildung erforderlich zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese ist sowohl in physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt sind. Studium der Mechanismen der Angiogenese beteiligt die Verwendung von Assays, die die Hauptschritte bei der Angiogenese rekapitulieren. Die Endothelzellen Rohr-Assay bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Tests. Es ist einfach zu Set-up, ist relativ kostengünstig, produziert Tubuli innerhalb von Stunden, und quantifizierbar ist. Ferner kann sie in 24 oder 96-Well-Platten durchgeführt werden, und können somit zur Hochdurchsatz-Sc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Cancer Institute an der National Institutes of Health, und NCI gewähren UA5CA152907.
Materials
| Item | Manufacturer | Catalog # |
| Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
| BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
| Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
| Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
| Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
| Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
| Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
| Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
| DMSO | ATCC | 4-X |
References
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