De buisvorming assay is een snelle, meetbare werkwijze voor het meten in vitro angiogenese. Endotheelcellen worden gecombineerd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan extract. Tube vorming gebeurt binnen enkele uren en nieuw gevormde buisjes gemakkelijk gekwantificeerd.
Angiogenese is een belangrijke werkwijze voor normale ontwikkeling weefsel en wondgenezing, maar wordt ook geassocieerd met een verscheidenheid aan pathologische aandoeningen. Met dit protocol kan angiogenese worden gemeten in vitro in een snelle, kwantificeerbare wijze. Primaire of geïmmortaliseerde endotheel cellen gemengd met geconditioneerd medium en uitgeplaat op basale membraan matrix. De endotheliale cellen vormen capillaire structuren in reactie op angiogene signalen in geconditioneerd medium. De buis formatie optreedt snel met endotheelcellen beginnen zich aan te sluiten binnen 1 uur en-lumen met buisjes beginnen te verschijnen binnen 2 uur. Buizen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een fase-contrast omgekeerde microscoop, of de cellen worden behandeld met calceïne AM vóór de assay en pijpen gevisualiseerd door fluorescentie of confocale microscopie. Het aantal filialen / nodes, lussen / meshes of het aantal of lengte van buizen gevormde gemakkelijk worden gekwantificeerd als maat in vitro angiogenese. Samenvattend, kan deze test gebruikt worden om genen en routes die betrokken zijn bij de bevordering of remming van angiogenese in een snelle, reproduceerbare en kwantitatieve wijze identificeren.
Angiogenese, de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen, is essentieel voor een verscheidenheid van werkwijzen waaronder orgaangroei, embryonale ontwikkeling en wondgenezing 1-3. Nieuw ontwikkelde bloedvaten, bekleed met endotheelcellen, toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar weefsels bevorderen immuunbewaking door hematopoietische cellen en afvoer van afvalproducten 2,4. Angiogenese is van groot belang tijdens de embryonale en foetale ontwikkeling. Dit proces blijft slapende in de volwassen behalve in tijden van wondheling, skeletopbouw, zwangerschap of tijdens de menstruele cyclus 1-3.
In de afgelopen twee decennia de belangrijkste moleculaire mechanismen die angiogenese reguleren zijn begonnen te ontstaan. Angiogenese is een strak gereguleerde evenement, in evenwicht gehouden door pro-en anti-angiogene signalen waaronder integrines, chemokines, angiopoietinen, zuurstof sensing agenten, junctionele moleculen en endogene remmers 5. Zodra proangiogenic signalen zoals basis fibroblast groeifactor (bFGF), vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), en epidermale groeifactor (EGF) activeert endotheliale celreceptoren de endotheelcellen proteasen de basale membraan degraderen. De endotheelcellen vervolgens prolifereren en migreren, die kiemen met een snelheid van enkele millimeters per dag 6,7.
Angiogenese is geassocieerd met verschillende pathologische aandoeningen zoals kanker, psoriasis, diabetische retinopathie, artritis, astma, auto-immuunziekten, infectieziekten en atherosclerose 8-10. Vanwege het belang van angiogenese in verschillende ziekten, het begrijpen van de genen en pathways die regelen dit proces is cruciaal voor de ontwikkeling van een beter therapeutica.
De buisvorming assay is een snelle en kwantitatieve werkwijze voor het bepalen van genen of routes die betrokken zijn bij angiogenese. Voor het eerst beschreven in 1988,de uitgangspunten van deze test zijn dat endotheelcellen behouden de mogelijkheid om te delen en snel migreren naar aanleiding van angiogene signalen 11-13. Verder worden endotheelcellen geïnduceerd te differentiëren en vormen buisvormige structuren indien gekweekt op een matrix van basaal membraan extract (BME). Deze buizen bevatten een lumen omringd door endotheelcellen elkaar verbonden door junctional complexen. Tube vorming gebeurt snel met de meeste buizen vormen in deze test binnen 2-6 uur, afhankelijk van de hoeveelheid en de aard van de angiogene stimuli.
Verschillende soorten endotheelcellen kan voor deze test zowel primaire cellen geïmmortaliseerde cellijnen 14,15. De cellijn die voor dit artikel was mouse 3B-11, maar dezelfde methode kan worden toegepast met andere endotheliale cellijnen zoals SVEC4-10 (muis) of primaire endotheelcellen zoals HUVEC (humane) cellen. Afhankelijk van de cellijn wordt gebruikt en of de endotheliale cells worden omgezet of niet-getransformeerde, zal optimalisatie moeten worden uitgevoerd om de ideale tijd nodig voor een goede vaatvorming identificeren.
Angiogenese is betrokken bij zowel de fysiologische en pathologische processen. Bestuderen mechanismen betrokken bij angiogenese vereist het gebruik van testen die de belangrijkste stappen in angiogenese recapituleren. De endotheelcel vaatvorming assay biedt verscheidene voordelen boven andere assays. Het is gemakkelijk op te zetten, is relatief goedkoop, produceert buisjes binnen enkele uren, en is meetbaar. Verder kan in 24-of 96-well platen voltooid en kan dus worden gebruikt voor high throughput screening om factore…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd mede ondersteund door de Intramurale Research Program van de National Cancer Institute van de National Institutes of Health, en door het NCI verlenen UA5CA152907.
Item | Manufacturer | Catalog # |
Costar 24-Well Tissue Culture-Treated Plate | Corning | 3524 |
BD Matrigel Basement membrane matrix, Growth factor reduced | BD Biosciences | 354230 |
Gibco 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 |
Gibco L-Glutamine 200mM (100X) | Life Technologies | 25030-081 |
Gibco Pen Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Gibco DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 |
Gibco DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 |
Fetal Bovine Serum | Atlas Biologicals | F-0500-A |
Calcein AM | Life Technologies | C3100MP |
DMSO | ATCC | 4-X |