Summary

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Published: November 03, 2014
doi:

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

Bu protokol, biz siRNA'ları kullanarak fare makrofaj hücre hatlarında genleri inhibe ve doğal immün yanıt üzerindeki bu tedavilerin etkilerinin izlenmesi için etkin yöntemler açıklanmaktadır. Bu prosedürler, orta ya da yüksek verimli bir şekilde RNAi ekranlar için izin veren, 96-kuyu formatında gerçekleştirildi.

Enfeksiyona yanıt olarak, insanlar hemen doğuştan gelen bağışıklık tepkisini daha yavaş olan ancak daha özel bir uyum sağlayıcı bağışıklık tepkisi. Bu hızlı doğal immün yanıt makrofajlar 1 olmak üzere fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri toplanmasını ve aktivasyonunu içerir. Klasik olarak aktif makrofajlar, akut enflamatuar yanıtlarda rol oynayan ve antimikrobiyal proteinlerin ve bileşiklerin, sitokinler ve kemokinleri ve antijenlerini 2,3 üretirler. Alternatif aktive makrofajlar hoşgörüyü, doku onarımı bakımı, bağışıklık düzenlenmesinde rol oynar ve 4-8 yara iyileşmesi. Çünkü işlevleri onların geniş dizi, Makrofajlar ateroskleroz, arterit, kanser ve 9 da dahil olmak üzere pek çok hastalıkta önemli bir rol oynayabilir. Bu nedenle, makrofajların çalışma hastalık alanları arasında bir yelpazede bir süre için bir araştırma anahtar alanı olmuştur.

Doğuştan gelen bağışıklık tepki olarak önemine rağmen, makrofajlar ile çalışmak için hücreler zor olabilir. Özellikle, toksisitesi, 10,11 makrofajların lipid reaktifler kullanılarak verimli transfeksiyona elde etmek zordur. Ayrıca, siRNA verimli makrofajlar teslim olduğunda bile, genellikle demonte RNAi neden geninin sağlamlığı oldukça ılımlı olabilir ve gen için gen arasında değişebilir.

Bu teknik zorlukları aşmak için, iki fare makrofaj hücre hatları, RAW264.7 17 ve J774A.1 18 transfeksiyonuna ve demonte teknikleri 12-16 optimize ettik. Bu yaklaşım, transfeksiyon için Amaxa Nucleofector 96 oyuklu Servisi Sistemi kullanır; bu sistemin96-çukurlu formatta 19 hücreleri transfekte etmek için özel reaktifler ve elektroporasyon bir kombinasyonunu kullanır. Transfeksiyondan ardından, yöntem hücresi geri kazanımı ve canlılığı maksimize etmek ve daha sonra, siRNA ile uyarılan gen demonte üst düzeye çıkarmak için tarif etmektedir. Bu yaklaşımın faydasını göstermek için, lipopolisakkarit (LPS) ile bu hücreleri uyarır ve çeşitli pro-enflamatuar sitokinlerin üretim düzeyinde doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin izlenmesi, aşağıdaki makrofaj hücre hatlarına siRNA taşınması için bir protokol açıklar. Biz üyeleri LPS ve diğer patojen ilişkili moleküler şekilleri (üzerine durmaktadır) duygusu, doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen Toll-benzeri reseptör (TLR) ailesi, hangi hedef örnek veri sağlar.

Protocol

Makrofaj Hücre Hatları 1. Bakım RAW264.7 Büyüme ve DMEM içinde J774A.1 hücre hatları,% 5 CO2 varlığında 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiştir. , Kısırlık korumaya yardımcı (bu kesinlikle gerekli olmasa da) medyaya% 1 penisilin / streptomisin (pen / strep) ekleyin. Kritik adım: makrofajlar verimli nakil ve siRNA kaynaklı gen demonte için sağlıklı bir durumda büyüyen emin olun. Bu makrofaj soylarında altında en iyi …

Representative Results

Bu yaklaşımı kullanarak transfeksiyon etkinliğini göstermek için, bir akış sitometresi (Şekil 1) kullanılarak, FITC-işaretli siRNA'nın alımını izlenir. Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı izlemek için bir yaklaşım kullanışlılığını tasvir etmek için, biz, RAW264.7 makrofaj hücre hattı bilinen doğuştan gelen bağışıklık düzenleyici genler hedef siRNA'lar transfekte LPS ile stimüle edilen hücreler, daha sonra pro-enflamatuar si…

Discussion

Çok sayıda çalışma, burada tek tek genler sıçangil makrofaj siRNA tarafından hedef alınmıştır yayınlanmıştır. Lipit aracılı transfeksiyon bireysel olarak makrofaj hücre hatlarına siRNA teslim etmek için kullanılmış olsa da, bu yöntemler, bir genden genine canlılığı, sınırlı gen demonte ve değişkenlik olası etkileri muzdarip. Orta veya yüksek verimli bir şekilde genlerin hedeflenmesi için kullanılabilecek daha sert tahlilleri geliştirmek için, gen demonte içinde daha fazla kıvam…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

Materials

Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electrooration Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPM1-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96 well tissue culture plates Fisher 07-200-89
96 well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFa Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT Bufer Qiagen 79216
Rneasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

References

  1. Kaufmann, S. H. E., Medzhitov, R., Gordon, S. . The innate immune response to infection. , (2004).
  2. Adams, D. O., Hamilton, T. A. The cell biology of macrophage activation. Annual review of immunology. 2, 283-318 (1984).
  3. Fujiwara, N., Kobayashi, K. Macrophages in inflammation. Current drug targets. Inflammation and allergy. 4, 281-286 (2005).
  4. Gordon, S., Martinez, F. O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 32, 593-604 (2010).
  5. Martinez, F. O., Helming, L., Gordon, S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annual review of immunology. 27, 451-483 (2009).
  6. Fairweather, D., Cihakova, D. Alternatively activated macrophages in infection and autoimmunity. Journal of autoimmunity. 33, 222-230 (2009).
  7. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. Journal of immunology. 181, 3733-3739 (2008).
  8. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23, 344-346 (2005).
  9. Burke, B., Lewis, C. E. . The macrophage. , (2002).
  10. Lee, G., Santat, L. A., Chang, M. S., Choi, S. RNAi methodologies for the functional study of signaling molecules. PloS one. 4, (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. Journal of biomolecular screening. 14, 151-160 (2009).
  12. Alper, S., et al. Identification of innate immunity genes and pathways using a comparative genomics approach. ProcNatl Acad Sci USA. 105, 7016-7021 (2008).
  13. De Arras, L., et al. An evolutionarily conserved innate immunity protein interaction network. J. Bio. Chem. , 1967-1978 (2013).
  14. Yang, I. V., et al. Novel regulators of the systemic response to lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 45, 393-402 (2011).
  15. Yang, I. V., et al. Identification of novel innate immune genes by transcriptional profiling of macrophages stimulated with TLR ligands. Molecular immunology. 48, 1886-1895 (2011).
  16. Yang, I. V., et al. Identification of novel genes that mediate innate immunity using inbred mice. Genetics. 183, 1535-1544 (2009).
  17. Raschke, W. C., Baird, S., Ralph, P., Nakoinz, I. Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus. Cell. 15, 261-267 (1978).
  18. Ralph, P., Moore, M. A., Nilsson, K. Lysozyme synthesis by established human and murine histiocytic lymphoma cell lines. The Journal of experimental medicine. , 1528-1533 (1976).
  19. Zumbansen, M., et al. First siRNA library screening in hard-to-transfect HUVEC cells. Journal of RNAi and gene silencing. 6, 354-360 (2010).
  20. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42, 145-151 (2008).
  21. Aliprantis, A. O., et al. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2. Science. 285, 736-739 (1999).
  22. Alexopoulou, L., Holt, A. C., Medzhitov, R., Flavell, R. A. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 413, 732 (2001).
  23. Conforti, R., et al. Opposing effects of toll-like receptor (TLR3) signaling in tumors can be therapeutically uncoupled to optimize the anticancer efficacy of TLR3 ligands. Cancer Res. 70, 490-500 (2010).
  24. Fernandez-Botran, R., Větvička, V. . Methods in Cellular Immunology. 8, 8 (2001).

Play Video

Cite This Article
De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

View Video