Summary

En utilisant l'ARN interférence pour étudier la réponse immunitaire innée dans les macrophages de souris

Published: November 03, 2014
doi:

Summary

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Abstract

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

Introduction

Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes efficaces pour inhiber des gènes dans des lignées cellulaires de macrophages de souris à l'aide de siRNA et de surveiller les effets de ces traitements sur la réponse immunitaire innée. Ces procédures sont effectuées en format 96 puits, permettant écrans ARNi de la mode à moyen ou haut débit.

En réponse à une infection, l'homme une réponse immunitaire innée immédiate et une réponse immunitaire adaptative plus lente mais plus précise. Cette réponse immunitaire innée rapide comprend le recrutement et l'activation des cellules immunitaires innées, y compris les macrophages phagocytaires 1. Macrophages activées de façon classique sont impliquées dans les réponses inflammatoires aiguës et produisent des protéines antimicrobiennes et composés, les cytokines et les chimiokines, et les antigènes présents 2,3. Macrophages activés alternativement jouent un rôle dans la régulation de l'immunité, le maintien de la tolérance, la réparation des tissus, cicatrisation des plaies et 4-8. En raison de leur large éventail de fonctions, Les macrophages peuvent jouer un rôle dans de nombreuses maladies, y compris l'athérosclérose, l'arthrite, le cancer et 9. Ainsi, l'étude des macrophages a été un élément clé de la recherche depuis un certain temps dans une grande variété de domaines des maladies.

En dépit de leur importance dans la réponse immunitaire innée, les macrophages peut être difficile de travailler avec des cellules. En particulier, il est difficile d'obtenir une transfection efficace en utilisant des réactifs lipidiques dans les macrophages sans toxicité associée 10,11. En outre, même lorsque le siRNA est rendu efficace à des macrophages, la robustesse de gène induite par ARNi démontable peut être assez souvent modérée et peut varier d'un gène à gène.

Pour remédier à ces difficultés techniques, nous avons optimisé la transfection et des techniques knockdown 12-16 dans deux lignées de cellules de type macrophage de souris, RAW264.7 17 et 18 J774A.1. Cette approche utilise la 96 puits système de navette Amaxa Nucleofector pour la transfection; ce systèmeutilise une combinaison de réactifs spécialisés et l'électroporation pour transfecter des cellules dans un format à 96 puits 19. Après la transfection, on décrit des procédés pour optimiser la récupération et la viabilité cellulaire et de maximiser la suite gène induite par effet de choc de siRNA. Pour illustrer l'utilité de cette approche, nous décrivons un protocole de délivrance d'ARNi de ces lignées de cellules macrophages, stimuler ces cellules avec du lipopolysaccharide (LPS) et contrôler la réponse immunitaire innée à l'échelle de la production de plusieurs cytokines pro-inflammatoires. Nous fournissons des données de l'échantillon dans lequel nous ciblons la famille des récepteurs Toll-like (TLR), dont les membres sentir LPS et autres motifs moléculaires de pathogènes associés (PAMP), pour réguler l'immunité innée.

Protocol

1. Entretien de lignées cellulaires de macrophages Cultiver RAW264.7 et des lignées de cellules J774A.1 dans du DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C en présence de 5% de CO 2. Pour aider à maintenir la stérilité, ajouter 1% de pénicilline / streptomycine (pénicilline / streptomycine) aux médias (bien que ce ne soit pas strictement nécessaire). Étape critique: Veiller à ce que les macrophages sont de plus en plus dans un état ​…

Representative Results

Pour démontrer l'efficacité de la transfection en utilisant cette approche, nous avons suivi l'absorption de FITC marqué siRNA l'aide d'un cytomètre de flux (Figure 1). Pour illustrer l'utilité de notre approche pour le suivi de la réponse immunitaire innée, nous avons transfecté siRNA ciblant des gènes de régulation de l'immunité innée connus dans la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7, stimulé les cellules avec L…

Discussion

De nombreuses études ont été publiées dans lequel les gènes individuels ont été pris pour cible par siRNA dans les macrophages murins. Bien que la transfection médiée par des lipides a été utilisé pour fournir des siRNA pour les lignées de cellules macrophages sur une base individuelle, ces méthodes souffrent des effets potentiels sur la viabilité, knock-down de gènes limitée, et la variabilité du gène à gène. Pour développer des tests plus robustes qui pourraient être utilisés pour cibler les g?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Thanks to Brad Lackford for assistance optimizing some of the techniques described in this manuscript.

Materials

Amaxa nucleofector 96-well shuttle system Lonza AAM-1001S
Amaxa SF cell line 96-well nucleofector kit Lonza V4SC-2096
RAW264.7 mouse macrophage cell line ATCC TIB-71
J774A.1 mouse macrophage cell line ATCC TIB-67
siGenome smartpool siRNA Dharmacon varies depending on gene
Non-targeting control siRNA pool Dharmacon D-001206-13-20
Block-iT fluorescent oligo for electrooration Invitrogen 13750062
Ultrapure E. coli O111:B4 LPS List Biological Laboratories 421
DMEM, high glucose Invitrogen 11995-065
RPM1-1640 Invitrogen 11875-093
Penicillin-Streptomycin Solution (Pen/Strep) Fisher SV30010
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200072
96 well tissue culture plates Fisher 07-200-89
96 well round bottom sterile plates (not coated) Fisher 07-200-745
Mouse IL-6 Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY406
Mouse TNFa Duoset ELISA kit R&D Biosystems DY410
Fluorescein diacetate Sigma-Aldrich F7378
RLT Bufer Qiagen 79216
Rneasy mini kit Qiagen 74134
Vybrant Phagocytosis Assay Kit Invitrogen V-6694

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Cite This Article
De Arras, L., Guthrie, B. S., Alper, S. Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages. J. Vis. Exp. (93), e51306, doi:10.3791/51306 (2014).

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