Evaluar el desarrollo de las células murino plasmocitoide dendríticas en las placas de Peyer Usando la transferencia adoptiva de Progenitores Hematopoyéticas
Summary
Este protocolo describe los procedimientos experimentales para evaluar la diferenciación de las células dendríticas plasmacitoides en las placas de Peyer a partir de progenitores comunes de células dendríticas, usando técnicas que implican el aislamiento mediada por FACS de células, la transferencia génica hidrodinámica, y análisis de flujo de subconjuntos inmunes en las placas de Peyer.
Abstract
Este protocolo detalla un método para analizar la capacidad de progenitores hematopoyéticos purificados para generar células dendríticas plasmacitoides (PDC) en el parche de Peyer del intestino (PP). Progenitores de células dendríticas comunes (LDC, lin – c-kit Lo CD115 + de Flt3 +) se purificaron a partir de la médula ósea de ratones C57BL6 por FACS y se transfirieron a ratones receptores que carecen de una población significativa PDC en PP, en este caso, IFNAR – / – los ratones se usaron como los destinatarios de transferencia. En algunos ratones, la sobreexpresión del ligando de Flt3 factor de crecimiento de células dendríticas (Flt3L) se aplica antes de la transferencia adoptiva de los CDP, usando la transferencia de genes hidrodinámico (HGT) de plásmido Flt3L-codificación. Flt3L sobreexpresión expande poblaciones de DC procedentes de transferidos (o endógenos) progenitores hematopoyéticos. A los 7-10 días después de la transferencia progenitor, PDC que surgen de los progenitores de forma adoptiva transferidos se distinguen de las células receptoras de labase de la expresión del marcador CD45, con PDC de los CDP transferidos siendo CD45.1 + y ser receptores CD45.2 +. La capacidad de los CDP transferidos a contribuir a la población PDC en PP y para responder a Flt3L se evaluó por citometría de flujo de PP suspensiones de células individuales de los ratones receptores. Este método puede ser usado para probar si otras poblaciones progenitoras son capaces de generar PP PDC. Además, este enfoque podría utilizarse para examinar el papel de los factores que se predice que afectan el desarrollo PDC en PP, mediante la transferencia de subconjuntos progenitoras con una caída apropiada, nocaut o sobreexpresión del factor de desarrollo putativo y / o mediante la manipulación de citocinas circulantes a través de HGT . Este método también puede permitir el análisis de cómo PDC PP afectan a la frecuencia o la función de otros subconjuntos inmunes en PP. Una característica única de este método es el uso de IFNAR – / – ratones, que muestran severamente reducida PP PDC en relación con los animales de tipo salvaje, por lo tanto allowing reconstitución de PP PDC en la ausencia de efectos de confusión de la irradiación letal.
Introduction
Este sentido, demuestran un protocolo para evaluar si progenitores de células dendríticas comunes (LDC) son capaces de dar lugar a la célula dendrítica plasmocitoide población (PDC) en las placas de Peyer (PP). El objetivo general de la utilización de este método fue el de evaluar la regulación del desarrollo del PDC en las placas de Peyer (PP PDC). La razón de que esto es importante es que PDC PP difieren de PDC se encuentran en otros tejidos, incluyendo la médula ósea, la sangre y el bazo, y por lo tanto no está claro si PDC PP y otras poblaciones PDC son de desarrollo y / o funcionalmente relacionadas. Específicamente, PDC son ampliamente conocidos por ser el principal tipo I de interferón (IFN) productores en el sistema hematopoyético, en respuesta a Toll-like receptor 7 y 9 (TLR7 / 9) la estimulación de la secreción de IFN rápido 1-3. Sin embargo, PDC PP son deficientes en la producción de IFN de tipo I en respuesta a la estimulación de TLR agonista 4,5. Por otra parte, PP PDC también difieren de PDC que se encuentran en la médula ósea y el bazo enque requiere señales del interferón de tipo I (IFN) receptor (IFNAR1) o la señalización de IFN STAT1 molécula para su desarrollo y / o acumulación 5. Estos datos han sugerido la posibilidad de que distintos mecanismos de regulación controlan PDC PP frente a PDC en otros órganos (por ejemplo, médula ósea, bazo) 5.
La razón que llevó al desarrollo de este método se basa en los últimos avances en la comprensión de células dendríticas (DC) la biología. La mayoría, si no todos, los subconjuntos de DC se derivan de progenitores hematopoyéticos que expresan el receptor de tirosina quinasa 3 similar al FMS (de Flt3) 6-10; sin embargo, el desarrollo de CC no está restringido a la mieloide clásico y vías linfoides. Por ejemplo, Flt3 + progenitores mieloides comunes (CMPS, lin – IL-7R – Sca-1 – c-kit + CD34 + FcγR más altas / -) dan lugar a los CDP (lin – c-kit lo CD115 + FIt3 +), which diferenciar aún más en los países en desarrollo y PDC convencionales (CDC) de 9,10. Por el contrario, de Flt3 + progenitores linfoides comunes (CLPS, lin – IL-7R + Sca-1 lo c-kit lo) se desarrollan principalmente en PDC 11. Por lo tanto, los estudios anteriores indican PDC surgen de, al menos, 2 poblaciones progenitoras hematopoyéticas distintas en el marco de la regulación de Flt3L, aunque el análisis típico se ha limitado a la médula ósea, el bazo y / o subconjuntos PDC sangre. Por lo tanto, la población (s) progenitor que genera PP PDC requiere investigación. La comprensión de los orígenes del PP PDC arrojará luz sobre si comparten vías de desarrollo comunes con otras poblaciones PDC, o utilizar mecanismos distintos durante su generación en el PP.
Una ventaja única del enfoque descrito en el presente documento es el uso de ratones que muestran una deficiencia grave en PP PDC como receptores para la transferencia adoptiva de células progenitoras hematopoyéticas. Los ratones con el gensupresión de tic en el gen que codifica IFNAR1 (IFNAR – / – ratones) o STAT1 (Stat1 – / -) reveló un agotamiento sorprendente en PP PDC 5. Por lo tanto, estas cepas proporcionan un entorno en el cual se reducen PDC PP, lo que permite estudios de transferencia adoptiva que se realizaron en ausencia de los regímenes de ablación celular potentes tales como la irradiación letal. Una fuerza adicional del método presentado aquí es el uso de la transferencia génica hidrodinámica (HGT) para estimular cantidades circulantes elevados de Flt3L. Esto proporciona un enfoque rentable para inducir Flt3L in vivo, en comparación con la inyección de la proteína recombinante. Numerosos estudios, incluyendo aquellos en nuestro laboratorio, han empleado HGT para inducir cantidades de citoquinas en una variedad de condiciones experimentales 5,12,13.
La división del trabajo y las funciones inmunológicas precisas para los países en desarrollo es de gran interés en la inmunología. En particular, el PDC son importantes mediadores de la tolerancia oral y anti-viral sistémicarespuestas, sin embargo, también parecen contribuir al desarrollo y persistencia de la autoinmunidad y el cáncer de 14-17. El protocolo se describe en este documento permitirá a los mecanismos de desarrollo que regulan PP PDC para ser más plenamente exploradas. Además, este enfoque puede permitir que los estudios para evaluar la función PP pDC, y puede ser extendida a la comprensión de la regulación y la función de otras poblaciones inmunes dentro de los PP.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica de transferencia adoptiva descrito en el presente documento evaluó la contribución de los CDP para la población PP PDC en ratones receptores que son deficientes en PP PDC (por ejemplo IFNAR – / – ratones). En experimentos futuros, será importante evaluar el potencial de otros subconjuntos progenitoras en la generación de PDC PP, en particular, si PDC PP derivan de Flt3 + CLPs. Esta pregunta es importante ya que no queda claro por qué PDC PP son especialmente sensibles a l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Alex Gelbard y Willem Overwijk para el asesoramiento sobre la transferencia génica hidrodinámica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (AI098099, SSO), el Centro MD Anderson para el Cáncer de la epigenética, el Centro MD Anderson para la Inflamación y Cáncer (SSW), y el Fondo RE Bob Smith Educación (HSL).
Materials
| C57BL/6J | JAX | 664 | |
| B6.SJL | JAX | 2014 | |
| RPMI | Invitrogen | 11875-093 | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352095 | |
| 50 ml conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Sterile surgical tweezers | |||
| Sterile small pair scissors | |||
| Sterile large pair scissors | |||
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 | |
| RBC lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| FACS buffer | PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized | ||
| Percoll | GE Healthcare | 17089102 | |
| 10XHBSS | Sigma | H4641 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Goat ant-rat IgG microbeads | Milteyni Biotec | 130-048-501 | |
| LD column | Milteyni Biotec | 130-042-901 | |
| Rat anti-D3 | BD Biosciences | 555273 | |
| Rat anti-CD19 | BD Biosciences | 553783 | |
| Rat anti-CD11b | BD Biosciences | 553308 | |
| Rat anti-CD11c | BD Biosciences | 553799 | |
| Rat anti-Ter119 | BD Biosciences | 553671 | |
| Anti-CD3 (PerCP) | eBiosciences | 45-0031 | |
| Anti-CD19 (PerCP) | eBiosciences | 45-0193 | |
| Anti-CD11b (PerCP) | eBiosciences | 45-0112 | |
| Anti-CD11c (PerCP) | eBiosciences | 45-0114 | |
| Anti-F4/80 (PerCP) | eBiosciences | 45-4801 | |
| Anti-Ter119 (PerCP) | eBiosciences | 45-5921 | |
| Anti-Sca-1 (PE.Cy7) | eBiosciences | 25-5981 | |
| Anti-CD115 (APC) | eBiosciences | 17-1152 | |
| Anti-c-kit (APC.Cy7) | eBiosciences | 47-1171 | |
| Anti-IL-7R (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-1271 | |
| Anti-Flt3 (PE) | eBiosciences | 12-1351 | |
| Anti-CD45.1 (APC.Cy7) | BD Biosciences | 560579 | |
| Anti-CD45.2 (PE.Cy7) | Biolegend | 109830 | |
| Anti-CD11c (Pacific Blue) | eBiosciences | 48-0114 | |
| Anti-B220 (APC) | eBiosciences | 25-0452 | |
| Anti-Siglec-H (PE) | eBiosciences | 12-0333 | |
| Anti-PDCA-1 (FITC) | eBiosciences | Nov-72 | |
| Cell sorter | BD Biosciences | e.g. BD Fortessa | |
| Heat lamp | |||
| Mouse restrainer | |||
| 1 ml syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 27½ G needles (sterile) | Becton Dickinson | 305109 |
References
- Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
- Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
- Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
- Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
- Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
- D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
- Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
- Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
- Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
- Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
- Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
- Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
- Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
- Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
- Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
- Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).
