Summary

造血前駆細胞の養子移入を使用して、パイエル板におけるマウス形質細胞様樹状細胞の開発を評価

Published: March 17, 2014
doi:

Summary

このプロトコルは、FACSを介した細胞の分離、流体力学的遺伝子導入、およびパイエル板の免疫サブセットのフロー分析を含む技術を使用して、一般的な樹状細胞前駆体からのパイエル板での形質細胞様樹状細胞の分化を評価するための実験手順について説明します。

Abstract

このプロトコルは、腸のパイエル板(PP)に形質細胞様樹状細胞(PDC)を生成するために、精製された造血前駆細胞の能力を分析する方法について詳しく説明します。一般的な樹状細胞前駆体(のCDP、LIN のc-kit LO CD115 +のFlt3 +)は 、FACSによりC57BL6マウスの骨髄から精製し、PPの大幅のpDCの人口が不足しているレシピエントマウスに移し、この場合、IFNAR – / –マウスは、転写レシピエントとして使用した。一部のマウスでは、樹状細胞増殖因子Flt3リガンド(Flt3Lを)の過剰発現は、Flt3Lをコードするプラスミドの流体力学的遺伝子導入(HGT)を用いて、従来のCDPの養子移入に施行された。のFlt3Lの過剰発現は、転送(または内因性)造血前駆細胞から発生するDC集団を拡張します。前駆転送後7〜10日で、養子移入前駆細胞から発生するのpDCは、上の受容細胞と区別された転送のCDPが+ CD45.1いると受信者がCD45.2 +のあることからpDCを持つCD45マーカー発現に基づい。 PP中のpDC集団に寄与するとのFlt3Lに応答する転写のCDPの能力は、レシピエントマウスからのPPの単一細胞懸濁液のフローサイトメトリーにより評価した。この方法は、他の前駆細胞集団は、PPのpDCを生成することができるかどうかを試験するために使用することができる。さらに、このアプローチは、HGTを介して循環するサイトカインを操作することによって、推定発達因子および/または適切なノックダウン、ノックアウトまたは過剰発現に前駆細胞サブセットを転送することにより、PP中のpDC発達に影響を与えると予測される因子の役割を調べるために使用することができる。この方法はまた、PPとのpDCはPP内の他の免疫サブセットの頻度または機能にどのように影響するかの分析を可能にすることができる。 – / –マウス、深刻な枯渇PP pDCを野生型マウスと比較して、このようにallowiを示し、この方法のユニークな特徴はIFNARの使用で致死照射からの交絡の影響がない状態でのPPのpDCのNG再構成。

Introduction

ここでは、一般的な樹状細胞前駆体(のCDP)はパイエル板(PP)の中の形質細胞様樹状細胞(PDC)の人口を生じさせることができるかどうかを評価するためのプロトコルを示しています。この方法を使用しての全体的な目標は、パイエル板(PPたpDC)中のpDCの発生調節を評価することであった。これが重要である理由は、PPのpDCは骨髄、血液および脾臓を含む他の組織に見出さのpDCは異なるので、それはPPのpDCに及び他のpDCの集団が発達および/または機能的に関連しているかどうかは不明であるということである。具体的には、pDCは広く、私はToll様受容体7と迅速なIFNの分泌1-3による9(TLR-7/9)の刺激に応答して、造血系内(IFN)生産インターフェロンプリンシパルタイプであることで知られています。しかし、PPのpDCは、私がTLRアゴニスト刺激4,5に応じて型IFNの産生が不足している。また、PPたpDCはまた、骨髄および脾臓で発見さたpDCと異なる型からの信号を必要とする私は(IFN)受容体(IFNAR1)をインターフェロンまたはIFNは彼らの開発および/ ​​または蓄積5用の分子STAT1シグナル伝達。これらのデータは、個別の調節機構がPPの他の器官のpDCに対するpDCに( 例えば 、骨髄、脾臓)5を制御する可能性を示唆している。

この方法の開発につながった理論的根拠は、樹状細胞(DC)生物学の理解における最近の進歩に基づいていた。ほとんどは、全てではない、DCサブセットがFMS様チロシンキナーゼ3受容体(のFlt3)6-10を発現する造血前駆細胞から派生したが、DCの開発は古典的な骨髄およびリンパ経路に限定されるものではない。たとえば、のFlt3 +は骨髄系共通前駆細胞(CMPの、LIN IL-7R SCA-1 のc-kit + CD34 +FcγRLO / – )のCDP(LIN のc-kit LO CD115 +のFlt3 +)を生じさせる、whicHは、さらにPDCと従来のDC(のCDC)9,10に分化する。これとは対照的に、のFlt3 +リンパ球系共通前駆細胞(CLPの、LIN IL-7R + SCA-1 LOのc-Kit LO)は pDCに11に、主に開発しています。したがって、従来の研究では、典型的な分析は、骨髄、脾臓および/または血液のpDCサブセットに制限されているがpDCには、のFlt3Lの調節下に少なくとも2つの異なる造血前駆細胞集団から生じる示す。このように、PPのpDCを生成前駆細胞集団(S)は、調査を必要とした。 PPのpDCの起源を理解することは、彼らが他のpDC集団と共通の発生経路を共有しているかどうかに光を当てる、または、PPでの生成中に別個の機構を利用します。

ここに記載されたアプローチのユニークな利点は、造血前駆細胞の養子移入の受容体としてのPPのpDCの深刻な不足を示しているマウスを使用することである。遺伝子を持つマウスまたはSTAT1( のStat1 – / – )をコードする遺伝子IFNAR1( – / –マウスIFNAR)中チック欠失はPPのpDC 5の著しい減少を明らかにした。したがって、これらの株は、養子免疫伝達試験は、例えば、致死的照射のような強力な細胞アブレーションレジームの非存在下で行うことができるように、PP用のpDCが低減された環境を提供する。ここで紹介する方法のさらなる強さのFlt3Lの上昇循環量を刺激する流体力学的な遺伝子導入(HGT)を使用することである。これは、組換えタンパク質の注入に対して、 生体内でのFlt3Lを誘導するためのコスト効果的なアプローチを提供します。私たちの研究室にあるものを含む多数の研究は、実験条件5,12,13様々なサイトカイン量を誘導するためにHGTを採用しています。

DCの労働力と正確な免疫機能の分割は、免疫学の主要な関心事である。特に、pDCは、経口寛容および全身抗ウイルスの重要なメディエーターである応答は、まだ彼らはまた、自己免疫および癌14〜17の発展と持続性に貢献すると思われる。ここに記載されているプロトコルは、PPのpDCを規制発達のメカニズムをより十分に検討できるようになります。また、このアプローチは、研究がPP pDCの機能を評価することを可能にし、PPの内の他の集団の免疫調節および機能の理解に拡張することができる。

Protocol

制度上の承認は、マウスを含む、本明細書に記載されているすべての実験操作のために、事前に取得する必要があります。これらは、骨髄前駆細胞の単離のためのC57BL6マウスの使用を含む、IFNAR – / -養子造血前駆細胞の転写およびインビボでのサイトカインの過剰発現のためHGTの使用のためのレシピエントとしてマウス。適切な住宅や動物のケアにも研究者や機関が提供…

Representative Results

我々の結果は、プロトコル2および3に詳述されるように、マウス骨髄細胞からのCDPの単離( 図1)のためのゲート戦略を示している。 CDPは、全骨髄細胞の約0.1%を含み、およそ4-6×10 4のCDPは、一匹のマウスから単離することができる。養子移入すると、CDPははPDCとCDCは10に分化する。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" fo…

Discussion

– / –マウスなどIFNAR)について説明養子転写技術は、ここにPPのpDCが不足しているレシピエントマウスにおけるPPのpDCの人口のCDPの寄与を評価した。将来の実験では、それは、PPのpDCはのFlt3 +のCLPから派生するかどうか、特に、PPたpDCを生成する際に、他の前駆細胞サブセットの可能性を評価することが重要になります。この質問は、PPのpDCがPP積算5 IFNAR…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、博士に感謝します。流体力学の遺伝子導入に関するアドバイスをアレックスGelbardとウィレムOverwijk。この作品は、NIH(AI098099、SSW)、癌エピジェネティクスのためのMDアンダーソンセンター、炎症および癌のためのMDアンダーソンセンター(SSW)とREボブ·スミス教育基金(HSL)からの補助金によって支えられている。

Materials

C57BL/6J JAX 664
B6.SJL JAX 2014
RPMI Invitrogen 11875-093
15 ml conical tubes BD Biosciences 352095
50 ml conical tubes BD Biosciences 352070
Sterile surgical tweezers
Sterile small pair scissors
Sterile large pair scissors
40 μm cell strainer BD Biosciences 352340
35 μm cell strainer cap tubes BD Biosciences 352235
RBC lysing buffer Sigma R7757
FACS buffer PBS, 2 mM EDTA, 1% FCS, filter sterilized
Percoll GE Healthcare 17089102
10XHBSS Sigma H4641
Collagenase IV Worthington LS004188
Goat ant-rat IgG microbeads Milteyni Biotec 130-048-501
LD column Milteyni Biotec 130-042-901
Rat anti-D3 BD Biosciences 555273
Rat anti-CD19 BD Biosciences 553783
Rat anti-CD11b BD Biosciences 553308
Rat anti-CD11c BD Biosciences 553799
Rat anti-Ter119 BD Biosciences 553671
Anti-CD3 (PerCP) eBiosciences 45-0031
Anti-CD19 (PerCP) eBiosciences 45-0193
Anti-CD11b (PerCP) eBiosciences 45-0112
Anti-CD11c (PerCP) eBiosciences 45-0114
Anti-F4/80 (PerCP) eBiosciences 45-4801
Anti-Ter119 (PerCP) eBiosciences 45-5921
Anti-Sca-1 (PE.Cy7) eBiosciences 25-5981
Anti-CD115 (APC) eBiosciences 17-1152
Anti-c-kit (APC.Cy7)  eBiosciences 47-1171
Anti-IL-7R (Pacific Blue) eBiosciences 48-1271
Anti-Flt3 (PE) eBiosciences 12-1351
Anti-CD45.1 (APC.Cy7) BD Biosciences 560579
Anti-CD45.2 (PE.Cy7) Biolegend 109830
Anti-CD11c (Pacific Blue) eBiosciences 48-0114
Anti-B220 (APC) eBiosciences 25-0452
Anti-Siglec-H (PE) eBiosciences 12-0333
Anti-PDCA-1 (FITC) eBiosciences Nov-72
Cell sorter BD Biosciences e.g. BD Fortessa
Heat lamp
Mouse restrainer
1 ml syringes Becton Dickinson 309602
27½ G needles (sterile) Becton Dickinson 305109

References

  1. Cella, M., et al. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat. Med. 5 (8), 919-923 .
  2. Siegal, F. P., et al. The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science. 284 (5421), 1835-1837 .
  3. Asselin-Paturel, C., et al. Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat. Immunol. 2 (12), 1144-1150 .
  4. Contractor, N., Louten, J., Kim, L., Biron, C. A., Kelsall, B. L. Cutting edge: Peyer’s patch plasmacytoid dendritic cells (pDCs) produce low levels of type I interferons: possible role for IL-10, TGFbeta, and prostaglandin E2 in conditioning a unique mucosal pDC phenotype. J. Immunol. 179 (5), 2690-2694 (2007).
  5. Li, H. S., et al. Cell-intrinsic role for IFN-alpha-STAT1 signals in regulating murine Peyer patch plasmacytoid dendritic cells and conditioning an inflammatory response. Blood. 118 (14), 3879-3889 (2011).
  6. D’Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198 (2), 293-303 .
  7. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 .
  8. Liu, K., et al. In vivo analysis of dendritic cell development and homeostasis. Science. 324 (5925), 392-397 (2009).
  9. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. 8 (11), 1217-1226 .
  10. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8 (11), 1207-1216 (2007).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121 (1), 11-19 .
  12. Hirai, H., et al. C/EBPbeta is required for ’emergency’ granulopoiesis. Nat. Immunol. 7 (7), 732-739 (2006).
  13. Overwijk, W. W., et al. Immunological and antitumor effects of IL-23 as a cancer vaccine adjuvant. J. Immunol. 176 (9), 5213-5222 (2006).
  14. Cervantes-Barragan, L., et al. Plasmacytoid dendritic cells control T-cell response to chronic viral infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (8), 3012-3017 (2012).
  15. Goubier, A., et al. Plasmacytoid dendritic cells mediate oral tolerance. Immunity. 29 (3), 464-475 (2008).
  16. Lande, R., et al. Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus. Sci. Transl. Med. 3 (73), .
  17. Liu, C., et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. J. Clin. Invest. 118 (3), 1165-1175 (2008).
  18. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 63-72 (2003).
  19. Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
  20. Blasius, A. L., et al. Bone marrow stromal cell antigen 2 is a specific marker of type I IFN-producing cells in the naive mouse, but a promiscuous cell surface antigen following IFN stimulation. J. Immunol. 177 (5), 3260-3265 (2006).
  21. Symons, A., Budelsky, A. L., Towne, J. E. Are Th17 cells in the gut pathogenic or protective. Mucosal. Immunol. 5 (1), 4-6 (2012).

Play Video

Cite This Article
Li, H. S., Watowich, S. S. Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer’s Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors. J. Vis. Exp. (85), e51189, doi:10.3791/51189 (2014).

View Video