Summary

Siguiendo en tiempo real el impacto de factores de virulencia neumocócica en un ratón de neumonía aguda modelo utilizando bacterias bioluminiscentes

Published: February 23, 2014
doi:

Summary

Streptococcus pneumoniae es el patógeno que lleva causando neumonía adquirida en la comunidad grave y responsable de más de 2 millones de muertes en todo el mundo. El impacto de los factores bacterianos implicados en la aptitud o la virulencia se puede controlar en tiempo real en una neumonía o bacteriemia modelo agudo ratón utilizando bacterias bioluminiscentes.

Abstract

La neumonía es una de los principales problemas de salud en países en desarrollo e industrializados y se asocia con una considerable morbilidad y mortalidad. A pesar de los avances en el conocimiento de esta enfermedad, la disponibilidad de las unidades de cuidados intensivos (UCI), y el uso de potentes agentes antimicrobianos y vacunas eficaces, las tasas de mortalidad siguen siendo elevados 1. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en seres humanos. Este patógeno está equipado con un arsenal de adhesinas de superficie expuesta y factores de virulencia que contribuyen a la neumonía y la enfermedad neumocócica invasiva (ENI). La evaluación de la función in vivo de los factores de aptitud o de virulencia bacteriana es de suma importancia para desentrañar S. mecanismos de patogenicidad pneumoniae. Los modelos murinos de neumonía, bacteremia y meningitis se utilizan para determinar el impacto de los factores de neumococo en difeFerent etapas de la infección. Aquí se describe un protocolo para controlar la difusión de neumococo en tiempo real en los ratones después intranasal o infecciones intraperitoneales con bacterias bioluminiscentes. Los resultados muestran la multiplicación y difusión de neumococos en el tracto respiratorio inferior y la sangre, que puede ser visualizado y evaluado utilizando un sistema de imagen y el software de análisis adjunto.

Introduction

Infecciones de las vías respiratorias causadas por virus o bacterias siguen siendo uno de los problemas o adquiridas en la comunidad clínicas más comunes en todo el mundo que causan aproximadamente un tercio de todas las muertes en todo el mundo. Las especies bacterianas clave son Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae 2. Sin embargo, estas especies bacterianas son normalmente constituyentes comunes de la flora del tracto respiratorio naturales. Así carro bacteriana es también de cierto riesgo para la enfermedad invasiva y dependiendo del estado inmunitario o predisposiciones de los individuos. La colonización asintomática se dispara a las infecciones invasivas. Streptococcus pneumoniae es el patógeno principal de neumonía adquirida en la comunidad (NAC) y una de las causas más comunes de la bacteriemia en los seres humanos. En individuos sanos S. pneumoniae (neumococo) son a menudo asintomáticos colonizadores e inofensivos del tracto respiratorio superior, donde se enfrentan a las bacterias patógenasde la flora residente, sino también con agentes patógenos como Haemophilus spp. o Staphylococcus aureus y la primera línea del sistema de defensa inmunológico humano. Las tasas de transporte son más altos en los niños pequeños (37%) e incluso superior en los centros de atención de día de hacinamiento (58%) 3-5. La población más joven y el anciano, que recibe el neumococo a través de la transmisión por aerosol de los transportistas y las secreciones nasofaríngeas 6, pertenecen a los grupos de alto riesgo y la vacunación con una de las vacunas neumocócicas conjugadas (PCV10 o PCV13 en niños y 23-valente polisacárida PPSV23 en adultos) se recomienda en los Estados Unidos (EE.UU.) y muchos países europeos 4. El PPSV23 cubre los serotipos responsables de ~ 90% de las enfermedades neumocócicas bacteriemia en los EE.UU. y Europa, la prevención de enfermedades neumocócicas así eficientemente invasiva (ENI) en los adultos, mientras que los PCVs cubren los serotipos más prevalentes en los niños. En consecuencia, la ENI por tipos vacunales (VT) se reduserotipos no vacunales ced pero que muestran un alto potencial de virulencia y resistencia a los antibióticos se han convertido 4,7-12. La nasofaringe como reservorio es el punto de partida de los neumococos a extenderse a los senos paranasales o el oído medio que inician infecciones locales dañinos. Más importante aún, los neumococos difundir directamente a través de la vía aérea a los bronquios y del pulmón que resulta en peligro la vida de la PAC 4,13. Las infecciones pulmonares son acompañados a menudo con el tejido y destrucción de la barrera, lo que permite al patógeno a extenderse a la sangre y causando IPD. Las incidencias de la PAC y la ENI son más altos en personas inmunodeprimidas o en los extremos de 4,13 años. Las circunstancias responsables de la conversión de un comensal a un patógeno con alta virulencia son aún objeto de debate. Sin embargo, además de los cambios en la susceptibilidad del huésped y la adaptación evolutiva acompañado con una mayor virulencia y el aumento de la resistencia a los antibióticos se han sugerido a tener un impacto crucial en el PNEinfecciones umococcal 14-16.

El patógeno está dotado de una multiplicidad de adhesinas que median el contacto íntimo de la mucosa células epiteliales. Después de superar la mucosidad de las vías respiratorias, la adhesión de neumococo a las células huésped se facilita a través de interacciones directas de adhesinas de superficie expuesta con los receptores celulares y mediante la explotación de componentes de la matriz extracelular o proteínas séricas como moléculas puente 4,17,18. Patógenos Como versátiles neumococos también están equipados con los factores involucrados en la evasión de los mecanismos de defensa del huésped inmune. Además, tienen la capacidad de adaptarse a diversos ambientes huésped, tales como el pulmón, la sangre y el líquido cefalorraquídeo (LCR), respectivamente 5,17,19,20.

El impacto de los factores bacterianos en las respuestas de la patogénesis y de acogida inflamatoria se investiga en modelos animales experimentales de la neumonía, bacteriemia o meningitis 21-25. A pesar de ser un patógeno humano, estos modelos son nosotrosll establecida para descifrar tropismo tisular neumocócica, los mecanismos de virulencia, o protectividad de candidatas a vacunas neumocócicas. El fondo genético de cepas puras ratón determina la susceptibilidad a los neumococos. Ratones BALB / c por vía intranasal infectados con neumococos se encontró que eran resistentes, mientras que CBA / Ca y SJL ratones eran más susceptibles contra infecciones neumocócicas 22. Esto implica que, de forma similar a los seres humanos, los antecedentes genéticos y los mecanismos de defensa del huésped determinar el resultado de la infección. Por lo tanto, se necesitan más esfuerzos para desentrañar loci de resistencia en el genoma de los ratones menos susceptibles a las infecciones neumocócicas. Los resultados han dado lugar a cambios en los protocolos de virulencia en vivo. En lugar de los ratones BALB / c endogámicos de uso frecuente en el pasado, las cepas de ratón outbred CD-1/MF1 altamente susceptibles se utilizan hoy en día a menudo para estudiar el efecto de la virulencia o la aptitud neumocócica pérdida de la función de factores de 26-28. Por otra parte, la disponibilidadde neumococos bioluminiscente y técnicas de formación de imágenes ópticas permite que el tiempo real bioimagen bioluminiscencia de las infecciones. En neumococos el casete del gen de luxABCDE optimizado (plásmido Paul-Un Tn 4001 luxABCDE Km R) ha sido insertado en un único sitio de integración del cromosoma por mutagénesis de transposones. Neumococos bioluminiscente se han empleado para evaluar la atenuación de los mutantes deficientes en neumocócicas de virulencia o aptitud factores y su translocación desde un sitio anatómico a otro 26,28-31.

Aquí les ofrecemos un protocolo para la bioimagen de infecciones neumocócicas en una neumonía murina o modelo de sepsis. La amplificación y la difusión de neumococos bioluminiscente en ratones por vía intranasal o por vía intraperitoneal infectados pueden ser fácilmente monitorizados en el tiempo utilizando un sistema de imagen óptica y el mismo animal en diferentes puntos de tiempo.

Protocol

Los experimentos de infección de los animales que aquí se describen deben realizarse en estricta conformidad con los planos local e internacional (por ejemplo, la Ley de Salud de la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio (FELASA)) directrices y reglamentos para el uso de animales vertebrados. Los experimentos tienen que ser aprobados por el comité de ética local y Comité de Cuidado de Animales institucional. Todos los experimentos con S. pneumoniae en el laboratorio o…

Representative Results

La adquisición y la absorción de la metionina es de importancia central para los neumococos a mantener la forma física en su nicho de acogida 32,33. La metionina ABC transportador de lipoproteína se codifica en D39 por el SPD _ 0151 genes (TIGR4: sp_0149) y nombró MetQ 32. Los neumococos producen más enzimas de la biosíntesis de la metionina (D39: Spd_0510 – Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 – Sp_0586, mete y metF). La falta de metionina en un medio químicamente definido af…

Discussion

Todos los experimentos realizados en animales tienen que ser aprobados por las autoridades locales y las comisiones de ética. En experimentos in vivo de infección de la carga bacteriana en los diversos nichos de acogida de animales infectados tiene que ser determinada en diversos puntos temporales después de la infección. Bajo estas condiciones experimentales los animales tienen que ser sacrificados antes del aislamiento de las bacterias de la sangre, nasofaringe, lavado bronchoalvelar, o órganos tal…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La investigación en el laboratorio fue apoyado por becas de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, DFG HA 3125/4-2) y el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) Genómica Médica Infección (FKZ 0315828A) a SH.

Materials

Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376
fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok™ syringes with needle
Gel Loader Tips peqlab 81-13790 MµltiFlex™ Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001
Isofluoran Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit Qiagen, Hilden, Germany 27104
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106
Equipment
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany

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Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

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