Summary

Après en temps réel l'impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Published: February 23, 2014
doi:

Summary

Streptococcus pneumoniae est l'agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L'impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë.

Abstract

La pneumonie est l'un des principaux problèmes de santé dans les pays en développement et les pays industrialisés et est associée à une morbidité et une mortalité considérables. Malgré les progrès dans la connaissance de cette maladie, la disponibilité des unités de soins intensifs (USI), et l'utilisation d'agents antimicrobiens puissants et des vaccins efficaces, les taux de mortalité restent élevés 1. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l'une des causes les plus courantes de bactériémie chez l'homme. Cet agent pathogène est équipé d'un arsenal de adhésines de surface exposée et facteurs de virulence qui contribuent à la pneumonie et les maladies invasives à pneumocoques (IIP). L'évaluation du rôle in vivo de facteurs de forme physique ou virulence bactérienne est de la plus haute importance à démêler S. mécanismes de pathogénicité pneumoniae. Les modèles murins de la pneumonie, la bactériémie et la méningite sont utilisés pour déterminer l'impact des facteurs de pneumocoques à différents stades de l'infection. Ici, nous décrivons un protocole pour surveiller en temps réel la diffusion pneumocoque chez la souris après des infections par des bactéries bioluminescentes intrapéritonéale ou intranasale. Les résultats montrent la multiplication et la diffusion des pneumocoques dans les voies respiratoires inférieures et du sang, qui peut être visualisée et évaluée en utilisant un système d'imagerie et le logiciel d'analyse d'accompagnement.

Introduction

Infections des voies respiratoires causées par des virus ou des bactéries restent l'un des problèmes les plus courants cliniques acquis communautaires ou à travers le monde causant environ un tiers de tous les décès dans le monde. Les espèces bactériennes clés sont Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae 2. Cependant, ces espèces bactériennes sont habituellement des constituants communs de la flore naturelles respiratoires des voies. Ainsi chariot de bactéries est également certain risque de maladie invasive et en fonction de l'état immunitaire ou prédispositions des individus. La colonisation asymptomatique est déclenché pour les infections invasives. Streptococcus pneumoniae est le principal agent pathogène de la pneumonie communautaire (PAC) et l'une des causes les plus courantes de bactériémie chez les humains. Chez les individus sains S. pneumoniae (pneumocoque) sont souvent asymptomatiques colonisateurs et inoffensifs des voies respiratoires supérieures, où ils sont confrontés à des bactéries non pathogènesde la flore résidente, mais aussi par des agents pathogènes tels que Haemophilus spp. ou Staphylococcus aureus et la première ligne du système immunitaire humain de la défense. Les taux de portage sont les plus élevés chez les jeunes enfants (37%) et encore plus élevé dans les centres de soins de jour bondés (58%) 3-5. La population la plus jeune et les personnes âgées recevant le pneumocoque par la transmission par aérosol des transporteurs et des sécrétions naso-pharyngées 6, appartiennent à des groupes à haut risque et la vaccination à l'aide de l'un des vaccins antipneumococciques conjugués (de PCV10 ou PCV13 chez les enfants et 23-valent polysaccharide PPSV23 chez les adultes) Il est recommandé aux États-Unis (US) et de nombreux pays européens 4. Le PPSV23 couvre sérotypes responsables de ~ 90% des maladies pneumococciques bactériémiques aux États-Unis et en Europe, la prévention des maladies pneumococciques invasives ainsi efficacement (IPD) chez les adultes, tandis que les PCVs couvrent les sérotypes les plus fréquents chez les enfants. Par conséquent, IPD en raison de types de vaccins (VT) sont redusérotypes non vaccinaux ced mais présentant un potentiel de virulence élevée et résistance aux antibiotiques ont émergé 4,7-12. Le nasopharynx que le réservoir est le point de départ pour les pneumocoques se propager aux sinus ou des oreilles moyennes initiateurs infections locales dangereuses. Plus important encore, les pneumocoques se propager directement par la voie aérienne pour les bronches et les poumons entraînant mortelle PAC 4,13. Les infections pulmonaires sont souvent accompagnés de tissus et destruction de la barrière, permettant ainsi à l'agent pathogène de se propager dans le sang et provoquer IPD. Les incidences de la PAC et IPD sont les plus élevés chez les personnes immunodéprimées ou aux extrêmes de 4,13 ans. Les circonstances responsables de la conversion d'un commensal à un agent pathogène à haute virulence sont encore en discussion. Toutefois, outre l'évolution de la sensibilité de l'hôte et adaptation évolutive accompagnée de virulence plus élevée et l'augmentation des résistances aux antibiotiques ont été suggéré d'avoir un impact crucial sur pneinfections umococcal 14-16.

L'agent pathogène est doté d'une multiplicité d'adhésines médiatrices contact intime de cellules épithéliales des muqueuses. Après avoir surmonté le mucus des voies respiratoires, l'adhésion des pneumocoques à des cellules hôtes est facilitée par l'intermédiaire d'interactions directes des adhésines de surface exposée avec des récepteurs cellulaires et en exploitant des composants de la matrice extracellulaire ou des protéines sériques comme des molécules de pontage 4,17,18. Pathogènes polyvalents pneumocoques sont également équipées de facteurs impliqués dans l'évasion des mécanismes de défense immunitaire de l'hôte. En outre, ils ont la capacité de s'adapter à différents milieux d'accueil tels que les poumons, le sang et le liquide céphalo-rachidien (LCR), respectivement 5,17,19,20.

L'impact des facteurs bactériens sur les réponses de la pathogenèse et d'accueil inflammatoire est étudiée dans des modèles animaux expérimentaux de la pneumonie, la bactériémie, la méningite ou 21-25. En dépit d'être un agent pathogène humain, ces modèles sont nousll établi à déchiffrer tropisme pneumocoque de tissu, les mécanismes de virulence, ou protectivity de candidats vaccins contre le pneumocoque. Le fond génétique des souches de souris consanguines détermine la susceptibilité à pneumocoques. Des souris BALB / c infectées par voie intranasale les pneumocoques se sont révélés être résistants, alors que les souris CBA / Ca et SJL étaient plus sensibles contre les infections à pneumocoque 22. Cela implique que, comme pour les humains, la génétique et les mécanismes de défense de l'hôte de déterminer le résultat de l'infection. Par conséquent, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour démêler locus de résistance dans le génome de la souris moins sensibles aux infections pneumococciques. Les résultats ont conduit à des changements in vivo dans des protocoles de virulence. Au lieu des souris BALB / c consanguines souvent utilisés dans le passé, les souches de souris consanguines très sensibles de CD-1/MF1 sont aujourd'hui souvent utilisées pour étudier l'effet de la virulence ou d'adaptation à pneumocoques perte de fonction de facteurs 26-28. En outre, la disponibilitédes pneumocoques bioluminescentes et techniques d'imagerie optique permet en temps réel bioluminescence bio-imagerie des infections. En pneumocoques la cassette du gène luxABCDE optimisé (plasmide Paul-A Tn 4001 luxABCDE Km r) a été inséré dans un site unique d'insertion du chromosome par mutagénèse par transposon. Pneumocoques Bioluminescent ont été employés pour évaluer l'atténuation de mutants pneumococciques virulence ou déficients en facteurs de remise en forme et de leur translocation d'un site anatomique dans un autre 26,28-31.

Ici, nous fournissons un protocole pour la bio-imagerie des infections à pneumocoque dans une pneumonie murine ou modèle de septicémie. L'amplification et la diffusion des pneumocoques chez des souris par voie intranasale bioluminescent ou infectées par voie intrapéritonéale peuvent facilement être contrôlées au cours du temps en utilisant un système d'imagerie optique et le même animal, à différents points dans le temps.

Protocol

Les expériences d'infection animale décrites ici doivent être effectuées en stricte conformité avec la (par exemple le droit européen de la santé de la Fédération des animaux de laboratoire Sciences associations (FELASA)) locale et internationale guidelines et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés. Les expériences doivent être approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnels comité d'éthique local et. Toutes les expériences avec S. pneumoniae</…

Representative Results

L'acquisition et l'utilisation de la méthionine est d'une importance centrale pour les pneumocoques pour se maintenir en forme dans leur créneau d'accueil 32,33. La méthionine transporteur ABC lipoprotéine est codé dans D39 par le SPD _ 0151 gènes (TIGR4: sp_0149) et nommé MetQ 32. Pneumocoques produire plus d'enzymes de biosynthèse de la méthionine (D39: Spd_0510 – Spd_0511; TIGR4 Sp_0585 – Sp_0586, Mete et METF). L'absence de méthionine…

Discussion

Toutes les expériences menées sur des animaux doivent être approuvés par les autorités locales et les commissions d'éthique. Expériences in vivo d'infection dans la charge bactérienne dans les différents créneaux d'accueil des animaux infectés doit être déterminée à différents moments après l'infection. Dans ces conditions expérimentales, les animaux doivent être sacrifiés avant l'isolement des bactéries à partir du sang, du nasopharynx, lavage bronchoalv…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche dans le laboratoire a été financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG HA 3125/3-2, 3125/4-2 DFG HA) et le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF) génomique d'infection médicale (FKZ 0315828A) à SH.

Materials

Todd Hewitt broth Carl Roth, Karlsruhe, Germany X936.1
Yeast extract Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2363.2
Blood agar plates Oxoid, Wesel, Germany PB5039A
Kanamycin Carl Roth, Karlsruhe, Germany T832.2
Erythromycin Sigma-Aldrich,Taufkirchen, Germany E6376
fetal bovine serum (FBS) PAA Laboratories, Coelbe, Germany A11-151
CD-1 mice, female Charles River, Sulzfeld, Germany CD1SIFE06W08W female CD-1 mice, six to eight weeks old
Ketamin 500mg, Curamed injection solution Schwabe-Curamed, Karlsruhe, Germany
Rompun 2%, injection solution Bayer Animal Health, Monheim, Germany
BD Plastipak 1 ml syringes Becton Dickinson, Heidelberg, Germany 300015 sterile Luer-Lok™ syringes with needle
Gel Loader Tips peqlab 81-13790 MµltiFlex™ Tips
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3884-100mg Hyaluronidase Type IV-S from Bovine test
Oxygen Air Liquide, Düsseldorf, Germany M1001L50R2A001
Isofluoran Baxter, Unterschleißheim, Germany
pGEM-T Easy Promega, Mannheim, Germany
Oligonucleotides Eurofins MWG, Ebersberg, Germany
Qiaprep Spin Midiprep Kit Qiagen, Hilden, Germany 27104
PCR DNA purification kit Qiagen, Hilden, Germany 28106
Equipment
Living Image 4.1 software Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
XGI-8 Gas Anesthesia System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
IVIS Spectrum Imaging System Caliper Life Sciences/PerkinElmer, Rodgau, Germany
Biophotometer Eppendorf AG, Hamburg, Germany

References

  1. Niederman, M. S., et al. Guidelines for the management of adults with community-acquired pneumonia. Diagnosis, assessment of severity, antimicrobial therapy, and prevention. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 1730-1754 (2001).
  2. WHO, The global burden of disease: 2004 update. World Health Organization. , (2008).
  3. Bogaert, D., et al. Colonisation by Streptococcus pneumoniae and Staphylococcus aureus in healthy children. Lancet. 363, 1871-1872 (2004).
  4. Gamez, G., Hammerschmidt, S. Combat pneumococcal infections: adhesins as candidates for protein-based vaccine development. Curr. Drug Targets. 13, 323-337 (2012).
  5. Mook-Kanamori, B. B., Geldhoff, M., vander Poll, T., Dvan de Beek, D. Pathogenesis and pathophysiology of pneumococcal meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 24, 557-591 (2011).
  6. Musher, D. M. How contagious are common respiratory tract infections. N. Engl. J. Med. 348, 1256-1266 (2003).
  7. Brueggemann, A. B., Pai, R., Crook, D. W., Beall, B. Vaccine escape recombinants emerge after pneumococcal vaccination in the United States. PLoS Pathog. 3, (2007).
  8. Munoz-Almagro, C., et al. Emergence of invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes in the era of 7-valent conjugate vaccine. Clin. Infect. Dis. 46, 174-182 (2008).
  9. Whitney, C. G. Impact of conjugate pneumococcal vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 24, 729-730 (2005).
  10. Whitney, C. G., et al. Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine. N. Engl. J. Med. 348, 1737-1746 (2003).
  11. Lynch, J. P., Zhanel, G. G. Streptococcus pneumoniae: epidemiology and risk factors, evolution of antimicrobial resistance, and impact of vaccines. Curr. Opin. Pulm. Med. 16, 217-225 (2010).
  12. Singleton, R. J., et al. Invasive pneumococcal disease caused by nonvaccine serotypes among Alaska native children with high levels of 7-valent pneumococcal conjugate vaccine coverage. JAMA. 297, 1784-1792 (2007).
  13. Dockrell, D. H., Whyte, M. K., Mitchell, T. J. Pneumococcal pneumonia: mechanisms of infection and resolution. Chest. 142, 482-491 (2012).
  14. Lieberman, T. D., et al. Parallel bacterial evolution within multiple patients identifies candidate pathogenicity genes. Nat. Genet. 43, 1275-1280 (2011).
  15. Yang, J., Tauschek, M., Robins-Browne, R. M. Control of bacterial virulence by AraC-like regulators that respond to chemical signals. Trends Microbiol. 19, 128-135 (2011).
  16. Young, B. C., et al. Evolutionary dynamics of Staphylococcus aureus during progression from carriage to disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4550-4555 (2012).
  17. Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat. Rev. Microbiol. 6, 288-301 (2008).
  18. Voss, S., Gamez, G., Hammerschmidt, S. Impact of pneumococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules on colonization. Mol. Oral Microbiol. 27, 246-256 (2012).
  19. Koppe, U., Suttorp, N., Opitz, B. Recognition of Streptococcus pneumoniae by the innate immune system. Cell. Microbiol. 14, 460-466 (2012).
  20. Paterson, G. K., Mitchell, T. J. Innate immunity and the pneumococcus. Microbiology. 152, 285-293 (2006).
  21. Gerber, J., et al. A mouse model of Streptococcus pneumoniae meningitis mimicking several features of human disease. Acta Neuropathol. 101, 499-508 (2001).
  22. Gingles, N. A., et al. Role of genetic resistance in invasive pneumococcal infection: identification and study of susceptibility and resistance in inbred mouse strains. Infect. Immun. 69, 426-434 (2001).
  23. Holmes, A. R., et al. The pavA gene of Streptococcus pneumoniae encodes a fibronectin-binding protein that is essential for virulence. Mol. Microbiol. 41, 1395-1408 (2001).
  24. Koedel, U., Klein, M., Pfister, H. W. New understandings on the pathophysiology of bacterial meningitis. Curr. Opin. Infect. Dis. 23, 217-223 (2010).
  25. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods Mol. Biol. 602, 405-410 (2010).
  26. Hartel, T., et al. Impact of glutamine transporters on pneumococcal fitness under infection-related conditions. Infect. Immun. 79, 44-58 (2011).
  27. Hermans, P. W., et al. The streptococcal lipoprotein rotamase A (SlrA) is a functional peptidyl-prolyl isomerase involved in pneumococcal colonization. J. Biol. Chem. 281, 968-976 (2006).
  28. Jensch, I., et al. PavB is a surface-exposed adhesin of Streptococcus pneumoniae contributing to nasopharyngeal colonization and airways infections. Mol. Microbiol. 77, 22-43 (2010).
  29. Kadioglu, A., et al. Pneumococcal protein PavA is important for nasopharyngeal carriage and development of sepsis. Mol. Oral Microbiol. 25, 50-60 (2010).
  30. Orihuela, C. J., Gao, G., Francis, K. P., Yu, J., Tuomanen, E. I. Tissue-specific contributions of pneumococcal virulence factors to pathogenesis. J. Infect. Dis. 190, 1661-1669 (2004).
  31. Francis, K. P., et al. Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon. Infect. Immun. 69, 3350-3358 (2001).
  32. Basavanna, S., et al. The effects of methionine acquisition and synthesis on Streptococcus pneumoniae growth and virulence. PLoS One. 8, (2013).
  33. Hartel, T., et al. Characterization of central carbon metabolism of Streptococcus pneumoniae by isotopologue profiling. J. Biol. Chem. 287, 4260-4274 (2012).
  34. Hammerschmidt, S., et al. The host immune regulator factor H interacts via two contact sites with the PspC protein of Streptococcus pneumoniae and mediates adhesion to host epithelial cells. J. Immunol. 178, 5848-5858 (2007).
  35. Voss, S., et al. The choline-binding protein PspC of Streptococcus pneumoniae interacts with the C-terminal heparin-binding domain of vitronectin. J. Biol. Chem. , (2013).
  36. Cartwright, K. Pneumococcal disease in western Europe: burden of disease, antibiotic resistance and management. Eur. J. Pediatr. 161, 188-195 (2002).
  37. vander Linden, M., Al-Lahham, A., Nicklas, W., Reinert, R. R. Molecular characterization of pneumococcal isolates from pets and laboratory animals. PLoS One. 4, (2009).
  38. Brehm, , et al. Sequence of the adenine methylase gene of the Streptococcus faecalis plasmid pAM beta 1. Nucleic Acids Res. 15, 3177 (1987).

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Saleh, M., Abdullah, M. R., Schulz, C., Kohler, T., Pribyl, T., Jensch, I., Hammerschmidt, S. Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria. J. Vis. Exp. (84), e51174, doi:10.3791/51174 (2014).

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