Здесь мы опишем метод для анализа изменений в инициации мРНК перевода эукариотических клеток в ответ на стресс условия. Этот метод основан на разделении скорости на градиентах сахарозы на перевод рибосом из не-переводные рибосом.
Точный контроль трансляции мРНК имеет основополагающее значение для эукариотической гомеостаза клеток, особенно в ответ на физиологической и патологической стресса. Изменения этой программы может привести к росту поврежденных клеток, отличительной чертой развития рака, или к преждевременной смерти клеток, таких как видно на нейродегенеративных заболеваний. Многое из того, что известно о молекулярную основу для поступательного контроля была получена из полисом анализа с использованием градиентной системы фракционирования плотности. Этот метод основан на ультрацентрифугирования цитоплазматических экстрактов на линейном градиенте сахарозы. После того, как спин завершена, система позволяет фракционирование и количественное определение центрифугировали зон, соответствующих различным перевод рибосом популяции, в результате чего профиль полисом. Изменения в профиле полисом свидетельствуют о изменениях или дефектов в инициации трансляции, которые происходят в ответ на различные виды стресса. Этот метод также позволяет оценить тыс.е роль специфических белков на инициации трансляции, а также измерять поступательное активность специфических мРНК. Здесь мы опишем наш протокол для выполнения профили полисом для оценки инициацию трансляции эукариотических клеток и тканей под либо нормальных или стрессовых условиях роста.
Эукариотические клетки постоянно встречаемся ряд вредных физиологических и экологических условиях стресса, которые требуют быстрого реагирования адаптивного клеток. Реакция на стресс сотовый включает в себя точный баланс между анти-выживания и про-выживания действующих факторов. Разрушение этого баланса может иметь необратимые последствия, ведущие развитие человеческих патологий, таких как рак и нейродегенеративные заболевания. Во время первой стадии реакции на стресс, клетки активируют пути про-выживания, которые включают скоординированное управление изменениями в экспрессии генов на уровне трансляции мРНК.
перевод мРНК у эукариот является сложным клеточный процесс, который включает в скоординированных взаимодействия между инициации трансляции факторов (EIFS), специфическая РНК-связывающих белков (RBDS) и молекул РНК 1. перевод мРНК делится на три этапа: инициирование, удлинение и прекращение. Хотя все три фазы могут быть регуlatory механизмы, трансляционные механизмы контроля нацелены в основном на этапе инициирования перевода, который, таким образом, представляет собой ограничивающую скорость стадию синтеза белка 2.
Инициация трансляции является весьма приказал процесс, который начинается с формирования eIF2a.GTP.Met-тРНК я встретил тройной комплекс и его последующее связывание с 40S рибосомы субъединицы, что приводит к образованию комплекса предварительно инициации. Следующим шагом является привлечение в преиниационного комплекса к мРНК, которая включает деятельность инициации трансляции таких факторов, как eIF4F и eIF3. 48S преиниационного комплекс таким образом подвергается конкретные конформационные изменения, которые позволяют эту технику, чтобы начать сканирование 5'-нетранслируемой области мРНК, пока он не признает инициирующий кодон августа Большинство факторов инициации трансляции затем освобожден и 60S субъединицы набираются сформировать 80S рибосом комплекс компетентным для перевода,т, который начинается синтез точка белка (рис. 1). Более одного 80S monosome можно переводить же мРНК в то время, производя так называемые полисомы (или полирибосомы). Плотность полисом на мРНК отражает инициирование, удлинение и прекращение ставки и, следовательно, является мерой переводимости определенного транскрипта. Однако полисом профиль используется в основном для оценки изменений в трансляции мРНК на стадии инициирования. Здесь мы использовали протеасомную ингибитор как ингибитора инициации трансляции. Лечение раковых клеток с этим препаратом вызывает реакцию на стресс, характеризующийся активации стресс-киназы имени HRI который фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF2a 3. Фосфорилирование eIF2a является одним из основных событий, приведших к ингибирования инициации трансляции в клетках млекопитающих 4.
Анализ полисом профиль на градиентах сахарозы позволяет измерять инициации трансляции на основе анализа плотности полисом, выделенных из клеток или тканей 9,11-14. Этот метод является лучшим (если не единственным) подход для измерения инициацию трансляции в естественных условия…
The authors have nothing to disclose.
ПА является получателем стипендии "Пьер Дюран" факультет медицины Университета Лаваля. Эта работа была поддержана естественным наукам и инженерным исследовательского совета Канады (СС-CG095386) в РМ полисом фракционатор была приобретена через Канадский фонд инновационного гранта (СС-GF091050) в RMR М проводит новую CIHR награду следователь зарплаты.
Мы благодарны д-ра. Е. Ханджян, И. Gallouzi, С. Ди-Марко и А. Cammas за полезные советы.
Cells | ||||
HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
Culture medium and Supplements | ||||
Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
Sucrose solutions | ||||
D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
Lysis buffer | ||||
Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
RNA Extraction | ||||
Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
Antibodies | ||||
anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
Others | ||||
Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
Materials | ||||
T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
Optical Microscope | Olympus CK2 |