כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.
שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.
תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA.
תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב '), ומולקולות RNA 1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה 2.
חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5'-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a 3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים 4.
ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות 9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור 15, וכ?…
The authors have nothing to disclose.
הרשות הפלסטינית היא נמען של מלגה "פייר דוראן" בפקולטה לרפואה של האוניברסיטה לאוול. עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (MOP-CG095386) ל RM fractionator polysome נרכש באמצעות קרן קנדית עבור חדשנות מענק (MOP-GF091050) לRMR M מחזיק הפרס משכורת חוקר חדש CIHR.
אנו אסירי תודה לבני זוג. א Khandjian, י Gallouzi, ס 'Di-מרקו וא' Cammas לעצות מועילות.
Cells | ||||
HeLa cervical cancer cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CCL-2 | ||
Schneider Drosophila embryonic cells | American Type Culture Collection (Manassas, VA; ATCC) | CRL-1963 | ||
Culture medium and Supplements | ||||
Schneider’s Drosophila Medium | Sigma-Aldrich | SO146-500ml | ||
DMEM | Life technologies | 11995-073 | ||
FBS | Fisher Scientist Scientist | SH30396-03 | ||
penicillin/streptomycin | Life technologies | 15140122 | ||
Sucrose solutions | ||||
D-Sucrose | Fisher Scientist | BP220-212 | ||
Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | ||
Blue Bromophenol | Fisher Scientist | B3925 | ||
Lysis buffer | ||||
Tris Hydrochloride | Fisher Scientist | BP153-500 | ||
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-100G | ||
NaCl | Tekniscience | 3624-05 | ||
DTT | Sigma-Aldrich | D 9779 | ||
Nonidet P40 (Igepal CA-630 ) | MJS Biolynx | 19628 | ||
SDS | Tekniscience | 4095-02 | ||
RNase inhibitor (RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor) | Life technologies | 10777-019 | ||
Antiproteases (complete, mini, EDTA free) | Roche | 11,836,170,001 | ||
RNA Extraction | ||||
Proteinase K | Life technologies | AM2542 | ||
Phenol: Chloroforme | Fisher Scientist | BP1754I-400 | ||
Chloroforme | Fisher Scientist | C298-500 | ||
Glycogen | Life technologies | 10814-010 | ||
Isopropanol | Acros organics | 327270010 | ||
Antibodies | ||||
anti-FMRP antibody | Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 | |||
anti-Ribosomal Protein L28 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-50362 | ||
Others | ||||
Proteasome inhibitor : Bortezomib | LC Laboratories | B-1408 | ||
DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D5758-25ml | ||
RNaseZAP Solution | Life technologies | AM9780 | ||
Materials | ||||
T25 cell culture flask | Corning | 430639 | ||
1cc U100 Insulin Syringe 28 G1/2 | Fisher Scientist | 148291B | ||
Tube ultra-centrifugation, PA, 12ml | Fisher Scientist | FSSP9763205 | ||
Isco Model 160 gradient former | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
Ultracentrifuge Sorvall OTD Combi | ||||
Thermo Scientific Sorvall Rotor TH-641 | Thermo scientific | 54295 | ||
Automated Density Fractionation System | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | 67-9000-177 | ||
Isco UA-6 UV-vis detector | Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA | |||
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo scientific | |||
Ultracentrifuge C 5415 | Eppendorf | |||
Optical Microscope | Olympus CK2 |