meningitidis Neisseria הוא הפתוגן ספציפי אדם שמדביק את כלי דם. בפרוטוקול זה microvessels אדם מוכנס בעכבר על ידי השתלת עור אנושי על עכברי חיסון. חיידקים לדבוק בהרחבה לכלי האנושי, שהובילו לניזק והתפתחות כלי דם של הפריחה purpuric נצפתה בדרך כלל במקרים של בני אדם.
Neisseria meningitidis גורם לאלח דם חמור, לעתים קרובות קטלני כאשר הוא נכנס לזרם הדם של בני האדם. זיהום גורם לנזק נרחב של כלי הדם וכתוצאה מכך הדליפה של כלי דם, ההתפתחות של פריחות purpuric ונימק רקמות סופו של דבר. לומד בפתוגנזה של זיהום זה היה מוגבל בעבר על ידי האדם ספציפי של החיידקים, מה שהופך במודלי vivo קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל אנושי לזיהום זה שבו עור אנושי, המכיל microvessels עורי, הוא מורכבים על עכברי מדוכאי חיסון. כלים אלה anastomose עם מחזור העכבר תוך שמירה על התכונות האנושיות שלהם. ברגע שהציג למודל, נ 'זה meningitidis לדבוק אך ורק לכולים האנושיים, וכתוצאה מכך לנזק רב בכלי דם, דלקת ובמקרים מסוימים להתפתחות של הפריחה purpuric. פרוטוקול זה מתאר את שלבי השתלה, זיהום והערכה של מודל זה בקונטהXT של נ ' זיהום meningitidis. הטכניקה עשויה להיות מיושמת לפתוגנים ספציפיים אדם רבים כי להדביק את זרם הדם.
אלח דם קרום המוח הוא זיהום בדם נולד לעתים קרובות קטלני הנגרם על ידי meningitidis Neisseria פתוגן החיידקים. חולי אלח דם קרום מוח לעתים קרובות בהווה עם פריחה petechial או purpuric על העור שלהם שהעבר היה קשור להרס של כלי דם נגרמים על ידי חיידקים במחזור ומוצרי חיידקי 1. ביופסיות עור של חולים קליניים מראות חיידקים הקשורים microvessels, לעתים קרובות ממלאים את כלי 2. מלבד דליפת חיידקים, פקקת נרחב, קרישה, גודש כלי דם ונראה באזורי purpuric 3-5. נזק בכלי דם זה יכול להוביל לנימק נרחב של העור ורקמות הסובבות, וכתוצאה מהטריה ואפילו קטיעה בניצולי קרום מוח. הבנה כיצד זיהום גורם לניזק בכלי דם זה חשוב כדי לייעל את אסטרטגיות מניעה וטיפול. רוב המחקר על אלח דם קרום המוח שבוצע במבחנה עלשורות תאים אנושיות בשל הייחוד האנושי של נ ' meningitidis. היבטים של זיהום רבים כבר למדו במבחנה כולל הידבקות חיידקים, תגובת תא מארחת, כמו גם תגובת ציטוקינים 6-9. פילי סוג IV (פריון כולל) היו מעורבים כאברון הידבקות הגדול לנ ' meningitidis משני תאי אפיתל ואנדותל 10. זה גם הוכח שהידבקות של נ ' meningitidis לארח תאים הוא מאמץ גזירה תלוי ולכן הוא חשב להיות קשור לשיעורי זרימת דם בנימי הדם 11. הדבר מצביע על הלחצים הדינמיים החיידקים להתמודד in vivo הם קריטיים להיווצרות מחלה. זה אולם קשה מאוד למודל המיקרו של כלי דם קטנים במבחנה.
קולט ההידבקות לNeisseria הפריון כולל עדיין אינו ידוע, ולכן לא ניתן בחזון אסטרטגיות לדפוק בלהשיג הידבקות חיידקים במודל חיה בשלב זה. CD46 הוצע להיות קולט הפריון כולל ובעלי החיים מהונדסים יוצרו לפעול כמודלים עכבר. עם זאת, זיהום בבעלי החיים אלה אינו מוביל לזיהום נרחב או לפריחת 12,13 פיתוח. מודלים של בעלי חיים אחרים, שתוארו להיבט קטרמיה של זיהום Neisseria לקחת בחשבון את העדפת החיידקים לtransferrin אנושי כמקור ברזל 14,15. כך או להשלים transferrin אדם או להביע אותו מתוצאות transgene בעומס חיידקים גדל בזרם הדם על פני תקופת זמן ממושכת, אבל מודל זה לא מראה הידבקות חיידקים או התפתחות הפריחה 16,17.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים מודל עכבר אנושי שבו עור אדם, כולל נימי דם עורי, הוא הושתל על עכברי מדוכאי חיסון 18,19. התוצאה היא כלי אנושי פונקציונלי, perfused עם מחזור העכבר. , מ 'בשילוב עם תוספי transferrin האנושי הזהאודל מהווה לפחות שני ההיבטים הספציפיים האדם של נ ' meningitidis, כלומר האנדותל אנושי וtransferrin אדם, בסביבה בvivo. נ meningitidis הציג לווריד למודל זה לדבוק במיוחד כדי האנדותל האנושי, ייצור פתולוגיה כי הוא דומה למה שדווח בחולים קליניים, כוללים נזק בכלי דם והתפתחות הפריחה purpuric 18.
מודלים של בעלי החיים חשובים באופן קריטי למחקר פתוגנזה של חיידקים. אי אפשר לחקות את הסביבה vivo בתרבית תאים באופן מלא וזה הופך להיות ברור כי האינטראקציה המאכסן לפתוגן מושפעת מגורמים דינמיים רבים. הייחוד האנושי של כמה פתוגנים חשובים קליני, כגון נ meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, חיידקי ליסטריה, וסלמונלה typhi הגביל את השימוש במודלי vivo לזיהומים אלה. עם זאת, כפי שאנו מתחילים להבין שצעדי זיהומיות מעורבים בסגולי, מודלים אנושיים מפותחים. הפרוטוקול המתואר כאן הוא הפגנה של זה עם ההקדמה של microvessels האנושי בעכברים, המאפשר נרחב בזיהום vivo עם נ ' meningitidis, וכתוצאה מכך לנזק בכלי דם ולעתים ההתפתחות של פריחות purpuric.
שימוש במודל זה,אנחנו כבר יכולים להגדיר שמאפייני ההדבקה של פריון הכולל מעורבים בהתישבות בכלי הדם בvivo באמצעות מוטציות בקטריאלי וכי הנזק בכלי הדם מופחת בהיעדר ההידבקות 18. בעבר, מוצרי חיידקים במחזור היו מעורבים בנזק הזה, אבל התוצאות שלנו מצביעות על תפקיד מכריע בהדבקה מקומית וקולוניזציה של כלי דם. זו פותחת אפשרויות חדשות לפיתוח של מטרות טיפול חדשני. אם הידבקות של חיידקים פתוגניים יכולה להיחסם pharmaceutically זה אולי יכול למנוע ההתפתחות של נגעי עור ולהוביל לתוצאות טובות יותר עבור ניצולי קרום מוח במונחים של נמק רקמות, הטרייה וקטיעות. העבודה הוכיחה גם את המורכבות של הזיהום ואת מעורבותם של התגובה החיסונית ומפל קרישה. זיהינו איתות ציטוקינים אדם בסרום של עכברים נגועים למרות הכמות הקטנה יחסית של האנדותל הווה האנושי 18.זה היה רמז לתגובת ציטוקינים משמעותי, יחד עם החדירה של אוכלוסיות תאים חיסוניים עכבר לאזור.
מודלים של בעלי חיים כמובן לא יכולים לשכפל באופן מלא מחלות של בני אדם וכל התוצאות זכו מהם יש לקחת בחשבון עם זה בחשבון. לדוגמא, במודל זה הדם ותאים במחזור הם ממוצא עכבר ולא ניתן לשלול כי הם עשויים להתנהג באופן שונה לתאים אנושיים. יתרון של זה עם זאת, כפי שמודגם בפרסום האחרון שלנו 18, הוא היכולת להבחין שמקורו איתות מהאנדותל האנושי מזה של תאי עכבר במחזור. רקע החיסון של העכברים משמשים במודל זה גם יאפשר את העברת allogenic של אוכלוסיות תאי חיסון אנושיות, והוסיף היבט 'האנשה' נוסף. רקע החיסון של העכברים עשוי עם זאת להסוות תפקיד לנ"ח, T או תאי B, אשר כולם חסרים או פגום במודל זה. שור יחסיתזמן t (24hr) המשמש במודל זה בעיקר נוגע לתגובה המולדת, אך לזיהומים לטווח ארוך והפיתוח של אפשרויות אחרות חסינות ייתכן שיצטרך להיחקר.
העור הוא אתר זיהום חשוב לנ meningitidis אלא שיש כמות קטנה יחסית של כלי אנושיים גם אומר שחיוץ הנתונים לזיהום מערכתי הכולל איברים רבים הוא קשה. בעוד מודל זה מאפשר לחקר התפתחות נגע עורי, צעדים חשובים של זיהום קרום המוח כגון מעבר אפיתל ודם למוח אינם כלולים. יש צורך בפיתוח נוסף של המודלים אנושיים האלה כדי לטפל בהיבטים שונים של זיהום. עם זאת מודל זה מציע פוטנציאל גדול לפתוגנים רבים אדם ספציפיים, במיוחד אלה המתמקדים בכלי הדם.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות לכל החברים במעבדה Dumenil, במיוחד סלקתי סילבה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחלקת הכירורגית בHôpital Europeen ז'ורז' פומפידו-(HEGP), ד"ר דוד Maladry. מיכאל Hivelin וד"ר פטריק Bruneval, פתולוגיה המחלקה בHEGP. מתקן בעלי החיים בPARCC, בראשותו של אליזבת איק. עבודה זו נתמכה על ידי סוכנויות המענק הבאות: אחוות מארי קירי IEF לא. 273,223 (KM), ATIP-Avenir גרנט מINSERM, מענק ציוד CODDIM (Ile de France אזור), FRM (Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר médicale) מענק ציוד, המעבדה IBEID של קונסורציום מצוינות, ANR (סוכנות הידיעות Nationale לשפוך משוכלל ונדיר לה) מענק " באגס-בזרימה ". היו הממנים שום תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם, או הכנה של כתב היד.
DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
(Rompun 2%) | |||
Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
Lacrigel | |||
Tronothane | Lisa Pharma | ||
GC agar Base | Conda | 1106 | |
Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
OCT tissue tek | Sakura | 4583 |