Neisseria meningitidis is een humaan specifieke ziekteverwekker die de bloedvaten infecteert. In dit protocol menselijke bloedvaten in een muis worden geïntroduceerd door enten menselijke huid op immuungecompromitteerde muizen. Bacteriën zich uitgebreid naar menselijke vaten, waardoor vasculaire beschadiging en ontwikkeling van de purpura uitslag typisch waargenomen in menselijke gevallen.
Neisseria meningitidis veroorzaakt een ernstige, vaak fatale sepsis als het de menselijke bloedbaan komt. Infectie leidt tot grote schade aan de bloedvaten waardoor vasculair lekken, de ontwikkeling van purpura uitslag en eventuele weefselnecrose. Het bestuderen van de pathogenese van deze infectie is eerder beperkt door de menselijke specificiteit van de bacteriën, waardoor in vivo modellen moeilijk. In dit protocol beschrijven we een gehumaniseerd model voor infectie waarin de menselijke huid, bevattende dermale microvaatjes wordt geënt op immuungecompromitteerde muizen. Deze schepen anastomoseren met de muis circulatie met behoud van hun menselijke eigenschappen. Eenmaal geïntroduceerd in dit model, N. meningitidis zich uitsluitend aan de menselijke vaten resulteerde in uitgebreide vasculaire beschadiging, ontsteking en in sommige gevallen de ontwikkeling van purpura uitslag. Dit protocol beschrijft het enten, infectie en evaluatie stappen van dit model in de context van N. meningitidis infectie. De techniek kan worden toegepast op tal van humaan specifieke pathogenen die de bloedstroom infecteren.
Meningokokkensepsis is een vaak fatale bloed geboren infectie veroorzaakt door de bacteriële pathogenen Neisseria meningitidis. Meningokokkensepsis patiënten vaak aanwezig met een petechiën of purpura uitslag op hun huid die eerder is geassocieerd met vasculaire vernietiging veroorzaakt door de verspreiding van bacteriën en bacteriële producten 1. Huid biopten van klinische patiënten vertonen bacteriën geassocieerd met microvaatjes, vaak vullen van de vaten 2. Naast de bacteriën uitgebreide trombose, coagulatie, congestie en vasculair lekken wordt gezien in de purpura gebieden 3-5. Deze vasculaire schade kan leiden tot uitgebreide necrose van de huid en de omringende weefsels, waardoor debridement en zelfs amputatie meningokokken overlevenden. Begrijpen hoe infectie veroorzaakt dit vasculaire schade belangrijk om preventie en behandeling te optimaliseren. Het merendeel van het onderzoek naar meningokokkensepsis is uitgevoerd in vitro ophumane cellijnen door de menselijke specificiteit van N. meningitidis. Veel aspecten van de infectie in vitro werd onderzocht waaronder bacteriële hechting gastheercel zelf en cytokine respons 6-9. Type IV pili (Tfp) zijn geïmpliceerd als de belangrijkste hechting organel voor N. meningitidis zowel epitheel-en endotheelcellen 10. Ook is aangetoond dat de aanhechting van N. meningitidis aan gastheercellen is schuifspanning afhankelijk en derhalve vermoedelijk samen met bloedstroomsnelheden in de microvasculatuur 11. Dit suggereert de dynamische spanningen van de bacteriën worden geconfronteerd in vivo zijn cruciaal voor de pathogenese. Het is echter moeilijk te voorspellen het micromilieu van kleine vaartuigen in vitro.
De adhesie receptor voor Neisseria Tfp is nog onbekend en daarom knock-strategieën om bacteriële hechting in een diermodel bereiken momenteel niet denkbaar. CD46 werd voorgesteld als Tfp receptor en transgene dieren geproduceerd om als muismodellen. Echter, infectie bij deze dieren niet tot uitgebreide infectie of ontwikkeling 12,13 huiduitslag. Andere diermodellen die zijn beschreven voor de bacteremia aspect van Neisseria infectie rekening gehouden met de bacteriële voorkeur voor humaan transferrine als ijzerbron 14,15. Ofwel aanvulling humaan transferrine of expressie uit een transgen resulteert in een verhoogde hoeveelheid bacteriën in de bloedstroom gedurende een langere periode, maar dit model vertoont geen bacteriële hechting of uitslag ontwikkeling 16,17.
In dit protocol beschrijven we een gehumaniseerd muismodel waarin de menselijke huid, zoals de huid microvasculatuur is getransplanteerd op immuungecompromitteerde muizen 18,19. Dit resulteert in functionele menselijke vaten, geperfuseerd met de muis circulatie. Gecombineerd met menselijke transferrine suppletie, dit mOdel een ten minste twee van de humaan specifieke aspecten van N. meningitidis, namelijk humane endotheel en humaan transferrine, in een in vivo omgeving. N. meningitidis intraveneus ingebracht in dit model specifiek hechten aan de menselijke endotheel, waardoor een pathologie die vergelijkbaar is met wat in klinische patiënten, omvattende vasculaire schade en purpura uitslag ontwikkeling 18.
Diermodellen zijn van cruciaal belang om bacteriële pathogenese onderzoek. Het is onmogelijk om de in vivo omgeving celkweek volledig nabootsen en het wordt duidelijk dat gastheer-pathogeen interactie wordt beïnvloed door veel dynamische factoren. De menselijke specificiteit van enkele klinisch belangrijke ziekteverwekkers, zoals N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, en Salmonella typhi heeft beperkt het gebruik van in vivo modellen voor deze infecties. Aangezien we beginnen te begrijpen die infectueus stappen betrokken bij de specificiteit, gehumaniseerde modellen ontwikkeld. De hier beschreven protocol is een demonstratie van deze met de introductie van menselijke microvaten in muizen, waardoor uitgebreide in vivo infectie met N. meningitidis, waardoor vasculaire schade en soms de ontwikkeling van purpura huiduitslag.
Met behulp van dit model,we kunnen definiëren die de kleefeigenschappen van Tfp betrokken bij vasculaire kolonisatie in vivo met bacteriemutanten en de vasculaire schade in afwezigheid van hechting 18 verminderd is. Eerder hebben circulerende bacteriële producten betrokken bij deze schade maar onze resultaten suggereren een beslissende rol voor lokale vasculaire adhesie en kolonisatie. Dit opent nieuwe mogelijkheden voor de ontwikkeling van nieuwe behandeling targets. Als adhesie van pathogene bacteriën farmaceutisch zou kunnen worden geblokkeerd het zou kunnen voorkomen dat de ontwikkeling van het huidletsel en leiden tot betere resultaten voor meningokokken overlevenden in termen van weefsel necrose, debridement en amputaties. Het werk heeft ook aangetoond dat de complexiteit van de infectie en de betrokkenheid van de immuunrespons en coagulatie cascade. Wij identificeerden menselijke cytokine signalering in het serum van geïnfecteerde muizen, ondanks de relatief kleine hoeveelheid humaan endotheel aanwezig 18.Dit bleek een belangrijke cytokine respons, samen met de infiltratie van immune muizen celpopulaties in het gebied.
Diermodellen kan natuurlijk nooit volledig repliceren menselijke ziekte en alle resultaten oogstte van hen moet worden geacht met dit in gedachten. Bijvoorbeeld in dit model het bloed circulerende cellen van muizen oorsprong kunnen we niet gelaten omdat ze anders kunnen gedragen aan menselijke cellen. Een voordeel hiervan echter, zoals aangetoond in onze recente publicatie 18, is de mogelijkheid om signalering afkomstig onderscheiden van de humane endotheel van die van de circulerende muiscellen. De immunocompromised achtergrond van de muizen die in dit model zou het ook mogelijk voor de allogene overdracht van menselijke immuuncelpopulaties, het toevoegen van een verdere 'vermenselijking' aspect. De achtergrond van de immuungecompromitteerde muizen kunnen echter masker een rol van NK, T of B-cellen, die alle ontbreken of defect in dit model. De relatief short tijdsbestek (24 uur) in dit model betreft voornamelijk de aangeboren respons, maar langere termijn infecties en de ontwikkeling van immuniteit andere opties moeten worden onderzocht.
De huid is een belangrijke infectie site voor N. meningitidis maar met een relatief kleine hoeveelheid menselijke voertuigen betekent ook dat extrapolatie van de gegevens tot een systemische infectie met vele organen moeilijk. Hoewel dit model maakt voor de studie van dermale laesies ontwikkelen, zijn belangrijke stappen meningokokken infectie zoals epitheel en bloed-hersenbarrière niet overschrijden. Verdere ontwikkeling van deze gehumaniseerde modellen nodig die andere aspecten van de infectie te pakken. Toch Dit model biedt enorm potentieel voor talrijke menselijke specifieke pathogenen, met name gericht op de bloedvaten.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag alle leden van de Dumenil lab, vooral Silke Silva bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. De operatie-afdeling van Hôpital Europeen Georges-Pompidou (HEGP), Dr David Maladry. Michael Hivelin en Dr Patrick Bruneval, afdeling Pathologie op HEGP. Het dier faciliteit op PARCC, onder leiding van Elizabeth Huc. Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidie agentschappen: Marie Curie IEF fellowship geen. 273223 (KM), ATIP-Avenir Grant van INSERM, CODDIM apparatuur subsidie (regio Ile de France), FRM (Fondation pour la recherche medicale) apparatuur subsidie, de IBEID Laboratorium voor uitmuntendheid consortium, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) subsidie " Bugs-in-flow ". De financiers hadden geen rol in onderzoeksopzet, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript.
DMEM | Gibco Invitrogen | 31885-023 | |
Phosphate buffered saline | Gibco Invitrogen | 10010-056 | |
Ketamine 500 | Virbac France | LOT N°VAL4243 | |
Xylazine | Bayer Healthcare | AMM N° FR/8146715 2/1980 | LOT N° KPO809S |
(Rompun 2%) | |||
Optigel | Europhta | Medicament autorisé N°3400933521134 | |
Lacrigel | |||
Tronothane | Lisa Pharma | ||
GC agar Base | Conda | 1106 | |
Human endothelium SFM media | Gibco Invitrogen | 11111 | |
Fetal bovine serum | P A A | A15-101 | |
Human transferrin | Sigma-Aldrich | T3309 | |
UEA lectin – rhodamine | Vector Labs | RL-1062 | |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
Eosin | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | |
Humeca BV, Holland | 4.SB01 | ||
Equiptment Name | Company | Catalogue Number | |
Sober Hand Dermatome | Humeca BV, Holland | 4.SB01 | |
Animal housing | Innovive | M-BTM-C8 | |
Biopsy punch (4 mm) | Dominic Dutscher | 30737 | |
Fast-Prep lysing matrix M tubes | MP Bio | 116923050 | |
MagNA Lyzer Green Beads | Roche | 3358941001 | |
MagNA Lyzer | Roche | 3358976001 | |
Vectashield mounting media | Vector Labs | H-1000 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | Tissue Glue |
OCT tissue tek | Sakura | 4583 |