גישה חדשה לניתוח השוואתי של multiprotein מכלולים בהתבסס על¹⁵ N מטבולית תיוג וכמותי ספקטרומטריית המסה

Summary

הגישה המתוארת ההשוואתית, כמותית proteomic מטרתה קבלת תובנות לתוך הרכב של מתחמי multiprotein בתנאים שונים ומודגמת על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית. ניתוח כמותי כמויות שווה של שברים שונים מצפיפות סוכרוז שיפוע מעורבבות ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.

Abstract

הפרוטוקול הציג מספק כלי לניתוח של מתחמי multiprotein בקרום thylakoid, על ידי גילוי תובנות קומפוזיציה מורכבת בתנאים שונים. בפרוטוקול זה הגישה באה לידי ביטוי על ידי השוואת הרכב של החלבון האחראי מורכב עבור זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF) בChlamydomonas reinhardtii, מבודדת מזנים שונים מבחינה גנטית. ההליך כולל בידוד של קרומי thylakoid, ואחרי הפרידה שלהם למתחמי multiprotein ידי צנטריפוגה סוכרוז שיפוע צפיפות, SDS-PAGE, immunodetection וספקטרומטריית השוואתית, כמותית מסה (MS) המבוססת על תיוג ההפרש מטבולים ⁽¹⁴ N / ¹⁵ N) של זנים נותחו. קרומי thylakoid solubilized דטרגנט נטענים על הדרגות צפיפות סוכרוז בריכוז כלורופיל שווה. לאחר ultracentrifugation, ההדרגות מופרדות לשברים, אשר נותחו על ידי המוני spectrometר"י מבוסס על נפח שווה. גישה זו מאפשרת החקירה של הרכב בתוך השברים השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את התנהגות הנדידה של חלבונים שונים, המתמקדת בעיקר על ANR1, CAS, וPGRL1. יתר על כן, שיטה זו באה לידי ביטוי על ידי המאשר את התוצאות עם immunoblotting ובנוסף על ידי תמיכה בממצאים ממחקרים קודמים (זיהוי וההגירה PSI תלוי של חלבונים שתוארו בעבר להיות חלק מCEF-supercomplex כגון PGRL1, FNR, ו cyt ו). יש לציין, גישה זו היא ישימה לטיפול במגוון רחב של שאלות שלפרוטוקול זה יכול להיות מאומץ ודוגמה המשמשת לניתוחים השוואתיים של קומפוזיציה מורכבת multiprotein מבודד מהתנאים סביבתיים שונים.

Introduction

תהליכי פוטוסינתזה בקרומי thylakoid של צמחים ואצות יכולים לתפקד במצב ליניארי והמחזורי. במהלך זרימת אלקטרונים ליניארי photosystem (LEF) אני (PSI), photosystem השנייה (PSII) ו ₆ / ו ב ציטוכרום סופו של דבר להעביר אלקטרונים ממים לNADP ¹ +, מוביל את הדור של NADPH ו-ATP ^2. בניגוד לכך, זרימה מחזורית אלקטרונים (CEF), אשר ידועה להיות מושרה בתנאים סביבתיים מגוונים כמו תנאי מדינה 2 ³ ואנאירוביים ^4, תוצאות מחדש הירידה של PSI חמצון על ידי הזרקה של אלקטרונים בחזרה לשרשרת העברת האלקטרונים. תהליך זה יכול להתרחש גם בצד של סטרומה ב ציטוכרום המורכב ₆ / F ¹ או בבריכת plastoquinone ⁵ ומייצר ATP, אך לא NADPH ^2.

מטרת הפרוטוקול המובא היא להדגים ספקטרומטריית מסה מ '(MS) המבוססethod לניתוח ההשוואתי, כמותי של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid של Chlamydomonas reinhardtii לקבל תובנות לתוך הרכב של מתחמים אלה בתנאים שונים (שהודגם על ידי השוואת זנים שונים מבחינה גנטית). גישה זו יושמה בפרסום על ידי Terashima et al. ב -2012 מראה ² רגולציה ⁺ תלויה Ca של CEF ב C. reinhardtii מתווך על ידי מורכב multiprotein כוללים החלבונים CAS, ANR1, וPGRL1 ^6. ההליך יהיה להיות מוסבר על ידי ניתוח יחסית הרכב CEF-supercomplex בשני זנים שונים מבחינה גנטית, ובכך מנצל את תיוג אחד משני זנים עם חנקן כבד ⁽¹⁵ N). בקצרה, הפרוטוקול כולל בין שאר הכנת קרומי thylakoid, ואחריו solubilization חומרי ניקוי וחלוקה של מתחמי פוטוסינתזה בשיפוע צפיפות סוכרוז. לאחר חלוקה של השיפוע, נבחר fractions של שני זנים מעורבבים המבוסס על נפח שווה, מופרד על ידי-SDS ואחרי עיכול וניתוח MS כמותיים שלאחר מכן בג'ל.

כפי שהוזכר לעיל, CEF הוא מושרה בתנאים סביבתיים שונים ופרסום מהשינה 2010 מדגים את הבידוד של CEF-supercomplex פונקציונלי ממדינה 2 תאים נעולים של ג reinhardtii ^7, אשר בוצע על ידי הפרדת קרומי thylakoid solubilized בשיפוע צפיפות סוכרוז במהלך ultracentrifugation. שונה מאיוואי et al. ^7, הפרוטוקול המובא מתאר את הבידוד של CEF-supercomplex מג אנאירובי גדל תרבויות reinhardtii על ידי ביצוע הליך חלופי. זה כולל שינויים בפרוטוקול בידוד thylakoid כמו גם הבדלים הנוגעים לצעד solubilization והפרדה של קומפלקסי חלבונים על ידי ultracentrifugation. בפרוטוקול הנוכחי, קרומי thylakoidהם מבודדים על ידי יישום ההליך בהוצאת Chua וBennoun ^8, ואילו המאגרים המשמשים להכנת thylakoid ידי איוואי et al. הכיל 25 Mes מ"מ, 0.33 M סוכרוז, 5 מ"מ MgCl _2, 1.5 מ"מ NaCl (pH 6.5) כפי שתואר ^9. Solubilization בוצע עם חומר ניקוי 0.7-0.8% (n-tridecyl-β-D-maltoside) ל30 דקות על קרח במקרה של איוי ועמיתים לעבודה, ואילו בשיטת solubilization המתוארת כאן מסתמכת על השימוש בחומרי ניקוי 0.9% (n -Dodecyl-β-D-maltoside (β-DM)) והיא מבוצעת רק 20 דקות על קרח. שני הקבוצות השתמשו 0.8 מ"ג כלורופיל לכל מיליליטר לsolubilization עם חומר הניקוי המתאים. להפרדה של קומפלקסים פוטוסינתטיים מקרומי thylakoid solubilized איוואי et al. מיושם ריכוזי סוכרוז בין 0.1-1.3 M, ואילו מחברים של פרוטוקול זה משמשים ריכוזים הנעים .4-1.3 מ 'ההבדל האחרון היא מהירות צנטריפוגה, שהוא נמוך יותר בהשוואה לeaפרסום rlier.

Solubilization של קרומי thylakoid עם חומרי ניקוי nonionic אחרי חלוקה צפיפות סוכרוז שיפוע כבר הותקן במספר רב של מחקרים החל 1980s עד היום ^{7, 9-14} וגם היישום של תיוג חילוף חומרים של חלבונים הוא שיטה נפוצה בתחום פרוטאומיקה. הגישה המתוארת חלה תיוג ¹⁵ N חילוף חומרים לאחד משני הזנים בהשוואה ידי culturing אותו בנוכחותם של חנקן כבד כמקור חנקן יחיד בצורה של ¹⁵ N NH ₄ Cl, אשר שולב כל חומצות אמינו שמובילות למסה משמרת בהתאם לרצף חומצות אמינו של הפפטיד. בעת ניתוח תערובת של ¹⁴ N ^ו15 N בתוך אחד MS לרוץ, משמרת מסה זו יכולה לשמש כדי לקבוע את מקורם המדגם עבור כל הפפטיד ופפטיד היחסי ניתן לחשב שכיחותם מייצגת שכיחותם היחסית עבור להתכתבing חלבון ^15.

מחקרי פרוטאומיקה כמותיים רבים על ג reinhardtii זמין, אשר משווה כמות מוגדרת של חלבון כדי לנתח שינויים בproteome בין תנאי ניסוי (למשל שינויים בproteome בשל תזונתי ^16-19 או אור לחץ ^20,21). בהשוואה למחקרים אלה, בגישה שהוצגה כיום כמויות שווה של דגימות משולבות ונותחו. התקנה זו מאפשרת ללמוד את התנהגות הנדידה של חלבונים בתוך השיפוע ויותר מכך כדי לנתח את ההרכב של מתחמים שונים ביחס לזנים הנחקרים.

שיטה זו להיות מוסברת על ידי בעיקר להתרכז בשלושה חלבונים: המועמד הראשון הוא CAS חלבון חיישן סידן מקומי הכלורופלסט, אשר הוצג להיות מעורבים בצילום ההסתגלות בג reinhardtii ^22. סידן נחשב אות חשובהing יון למסלולים אשר מופעלים כתוצאה מלחצים ביוטיים ואביוטי שונים סופו של דבר מוביל לשינויים בביטוי גנים ותא פיזיולוגיה ²³ והוצעו כי כלורופלסטים עשויים לתרום לסלולרי Ca ^{2 +} איתות באמצעות חלבון CAS ^22,24,25. החלבון השני הוא ANR1 (תגובה אנאירובית 1 ^6), חלבון שהוצג להיגרם תחת תנאי גידול anoxic בג reinhardtii ^26. יש לציין, CAS, כמו גם ANR1 זוהו כיחידות משנה של CEF-supercomplex ויותר מכך, על ידי שימוש בגישות גנטיות הפוכה, זה היה הוכיח כי שני החלבונים תורמים מבחינה תפקודית לCEF in vivo ^6, תומכים בתפקידם כיחידות משנה תפקודית של חלבון מורכב זה. החלבון השלישי הוא חלבון thylakoid PGR5-Like 1 (PGRL1), שהוצג להיות מעורבים בCEF בChlamydomonas ^4,27 כמו גם בארבידופסיס ^5,28 והיה גם identified בעבודתו של אל איוואי et. ⁷

גישה זו יוצגו על ידי המציג את התוצאות של שני ניסויים שונים: wildtype (WT) לעומת זן ΔPSI ²⁹ (לעומת), מציג מחיקה של גן psab, קידוד לphotosystem החיונית למקטע, שהוא גם חלק מ CEF-supercomplex וWT לעומת pgrl1 עקום החוצה רצף ^4. עבור כל אחד מניסויים אלה בהרכב הכמותי של CEF-supercomplex בין ¹⁵ N-ומתח ¹⁴ N שכותרתו הושווה.

Protocol

1. Culturing של Chlamydomonas ג הבא reinhardtii זנים ששימשו במחקר הנוכחי: cc124 WT, cw15-arg7 WT (auxotroph הלקוי וארגינין תא קיר), זן ΔPSI מוטציה 29 ומתח עקום החוצה pgrl1 4. כל הזנים גדלו בטריס…

Representative Results

גישת פרוטאומיקה כמותיים הציגה מטרה לאפיין את ההרכב של מתחמי multiprotein בקרומי thylakoid הודגמו על ידי הניתוח ההשוואתי של רכיבי CEF-supercomplex בג שונה מבחינה גנטית reinhardtii זנים. השיטה המתוארת בהצלחה יושמה על ידי Terashima et al. 6 וכוללת את הבידוד של קרומי thylakoid מתרב?…

Discussion

מחקרי proteomic כמותיים שונים באמצעות תיוג איזוטופ יציב כבר פורסמו בשנים האחרונות. בניסויים אלה בדרך כלל שני מדגמים שונים בהשוואה, מתוכם מדגם אחד מתויג עם איזוטופ יציב. לאחר מכן חלבונים או פפטידים משני המדגמים משולבים ביחס שווה ומעובד יחד נוסף ^48. מחקרים כאלה לעתים ?…

Materials

Chemicals
Acetic acid	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A0662
Acetone	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A2300
Acetonitrile Optigrade für LC-MS	Diagonal website: https://www.diagonal.de/	9340	harmful, work with gloves see protocol text for further precautions
Ammonium chloride 15N	Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm	39466-62-1
Ammonium chloride 14N	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A0988
Ammonium hydrogenphosphate	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A3583
Ammonium sulfate	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A3598
Coomassie brilliant blue R-250	Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex	10041653
n-Dodecyl-β-D-maltoside	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A0819
EDTA	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A2937
Formic acid	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A3858
Hepes	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A3724
Magnesium chloride	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A4425
Methanol	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A2954
Phosphorous acid	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A0989
Di-Potassium hydrogenphosphate	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A1042
Potassium di-hydrogenphosphate	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A1043
Sodium hydroxide	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A1551
Sucrose	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A1125
Tricine	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A3954
Tris	AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/	A2264
Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer	Promega website: http://www.promega.de/	V5111
Equipment
Neboulizer (BioNeb cell disruptor)	Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75
Centrifuge tubes (14 x 89 mm)  for preparation of takahashi style gradients	Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/	331372
Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients	Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/	344058
Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP	Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/
Fuchs-Rosenthal cell couting chamber	Diagonal website: https://www.diagonal.de/	449/72
Homogenizer (Potter) 50 ml	Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand	10618242
Pistil for homogenizer	Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand	105252220
Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)	Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/
Other
Antibodies	Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html