Ein neuer Ansatz für die vergleichende Analyse von Multiproteinkomplexen Basierend auf<sup> 15</sup> N Metabolische Markierung und quantitative Massenspektrometrie
Summary
Die beschriebenen Vergleichs, quantitative Proteomik-Ansatz zielt auf die Erlangung Einblicke in die Zusammensetzung von Multiproteinkomplexen unter verschiedenen Bedingungen und wird durch den Vergleich genetisch verschiedenen Stämmen nachgewiesen. Für die quantitative Analyse gleichen Volumina verschiedener Fraktionen aus einem Saccharose-Dichtegradienten durch Massenspektrometrie vermischt und analysiert.
Abstract
Das eingeführte Protokoll bietet ein Tool für die Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran, durch aufschlussreiche Einblicke in die komplexe Zusammensetzung unter verschiedenen Bedingungen. In diesem Protokoll wird der Ansatz durch den Vergleich der Zusammensetzung des Proteins für den zyklischen Elektronenfluss (CEF) in Chlamydomonas reinhardtii, isoliert aus genetisch unterschiedlichen Stämmen Komplex verantwortlich demonstriert. Das Verfahren umfasst die Isolierung von Thylakoidmembranen, gefolgt von der Trennung in die Multiproteinkomplexen durch Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation, SDS-PAGE, und Immunodetektion vergleichende quantitative Massenspektrometrie (MS) basierend auf Differenzial metabolische Markierung (14 N / 15 N) des Stämme analysiert. Waschmittel solubilisierten Thylakoidmembranen auf Saccharose-Dichtegradienten in gleichen Chlorophyllkonzentration geladen. Nach Ultrazentrifugation werden die Gradienten in Fraktionen, die durch Massen spectromet analysiert werden getrenntry zu gleichen Volumen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung der Zusammensetzung innerhalb der Gradientenfraktionen und darüber hinaus, um das Migrationsverhalten verschiedener Proteine zu analysieren, vor allem die Konzentration auf ANR1, CAS und PGRL1. Außerdem ist dieses Verfahren durch die Bestätigung der Ergebnisse mit Immunoblotting und zusätzlich, indem sie die Ergebnisse aus früheren Studien (die Identifizierung und PSI-abhängigen Migration der Proteine, die zuvor beschrieben wurden, einen Teil der CEF-Superkomplex wie PGRL1 FNR sein und zeigte cyt f). Bemerkenswert ist, ist dieser Ansatz für eine breite Palette von Fragen, auf die dieses Protokoll verabschiedet werden kann und beispielsweise für vergleichende Analysen von Multi komplexe Zusammensetzung aus unterschiedlichen Umgebungsbedingungen eingesetzt isoliert anzugehen.
Introduction
Photosyntheseprozesse Thylakoidmembran von Pflanzen und Algen in einer linearen und cyclischen Modus. Während der linearen Elektronenfluss (LEF) Photosystem I (PSI), Photosystem II (PSII) und Cytochrom b 6 / f letztlich Elektronen übertragen von Wasser zu NADP + 1, was zu der Erzeugung von NADPH und ATP 2. Im Gegensatz dazu zyklischen Elektronenfluss (CEF), die bekannt ist, um unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, wie der Zustand 2 3 und 4 anaeroben Bedingungen, Ergebnisse in der Rückreduktion des oxidierten PSI durch Injizieren von Elektronen in die Elektronentransportkette induziert werden. Dieser Prozess kann entweder an der Stroma-Seite des Cytochrom b 6 / f-Komplex 1 oder am Pool Plastochinons 5 finden kann und erzeugt ATP, aber kein NADPH 2.
Das Ziel der vorliegenden Protokolls ist es, eine Massenspektrometrie (MS) basierend m demonstrierenethode für die vergleichende quantitative Analyse von Multiproteinkomplexen in der Thylakoidmembran von Chlamydomonas reinhardtii, um Einblick in die Zusammensetzung dieser Komplexe unter verschiedenen Bedingungen (durch Vergleich der genetisch verschiedene Stämme beispielhaft) zu gewinnen. Dieser Ansatz wurde in einer Veröffentlichung von Terashima et al angewendet. Im Jahr 2012, die eine Ca 2 +-abhängige Regulation der CEF in C. reinhardtii von einem Multiproteinkomplex einschließlich der Proteine CAS, ANR1 und PGRL1 6 vermittelt. Das Verfahren wird durch vergleichsweise Analyse der Zusammensetzung der CEF-Superkomplex in zwei genetisch verschiedene Stämme, wodurch der Vorteil der Markierung eines der beiden Stämme mit schweren Stickstoff (N 15) erläutert. Kurz gesagt, enthält das Protokoll die Vorbereitung der Thylakoidmembran, gefolgt von Waschmittel Solubilisierung und Fraktionierung der Photosynthesekomplexe in einem Saccharose-Dichtegradienten. Nach Fraktionierung des Gradienten, ausgewählt fracgen der beiden Stämme gemischt, basierend auf dem gleichen Volumen von SDS-PAGE, gefolgt von In-Gel-Verdauung und anschließende quantitative MS-Analyse getrennt.
Wie oben erwähnt, wird CEF unter verschiedenen Umweltbedingungen induziert und eine Veröffentlichung aus dem Jahr 2010 zeigt die Isolierung eines funktionellen CEF-Superkomplex vom Zustand 2 verriegelt Zellen von C. reinhardtii 7, die durch die Trennung solubilisierten Thylakoidmembranen auf einem Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation bei geführt wurde. Anders Iwai et al. 7, das vorgestellte Protokoll beschreibt die Isolierung des CEF-Superkomplex aus der anaeroben gewachsen C. reinhardtii Kulturen, indem Sie ein alternatives Verfahren. Dies umfasst Veränderungen in der Thylakoidmembran Isolierungsprotokoll als auch Unterschiede in der Lösungsschritt und der Trennung der Proteinkomplexe durch Ultrazentrifugation. In dem vorliegenden Protokoll Thylakoidmembranendurch Anwendung der von Chua und Bennoun 8 veröffentlichten Verfahren, die Puffer für thylakoid Herstellung von Iwai et al verwendet isoliert. enthielt 25 mM MES, 0,33 M Saccharose, 5 mM MgCl 2, 1,5 mM NaCl (pH 6,5), wie beschrieben, 9. Die Solubilisierung wurde mit 0,7-0,8% Detergens (n-Tridecyl-β-D-maltosid) für 30 min auf Eis im Fall von Iwai und Mitarbeitern durchgeführt, während das hier beschriebene Solubilisierung Verfahren beruht auf der Verwendung von 0,9% Detergenz (n -Dodecyl-β-D-maltosid (DM-β)) und nur für 20 Minuten auf Eis durchgeführt. Beide Gruppen verwendeten 0,8 mg Chlorophyll pro ml für die Solubilisierung mit dem jeweiligen Reinigungsmittel. Für die Trennung von Photosynthesekomplexen aus solubilisierten Thylakoidmembranen Iwai et al. Angewendet Saccharose-Konzentrationen zwischen 0,1 bis 1,3 M, während die Autoren dieses Protokoll Konzentrationen im Bereich von 0,4 bis 1,3 M. Der letzte Unterschied ist die Zentrifugation Geschwindigkeit, die geringer ist im Vergleich auf der earlier Veröffentlichung.
Solubilisierung von Thylakoidmembranen mit nichtionischen Detergenzien, gefolgt von Saccharose-Dichtegradienten-Fraktionierung wurde bereits in zahlreichen Studien, die von den 1980er Jahren bis heute 7, 9-14 und auch die Anwendung von metabolischer Markierung von Proteinen ist ein weit verbreitetes Verfahren in dem Gebiet der Proteomik angewendet. Die beschriebene Vorgehensweise gilt die 15 N metabolische Markierung für eine der beiden verglichenen Stämme durch Kultivieren in Gegenwart von Schwer Stickstoff als einzige Stickstoffquelle in Form von 15 N NH 4 Cl, die in den Aminosäuren, die zu einer Masse eingeschlossen ist Verschiebung in Abhängigkeit von der Aminosäuresequenz des Peptids. Bei der Analyse einer Mischung von 14 N und 15 N in einem MS ausführen kann diese Massenverschiebung verwendet werden, um die Probe für jede Ursprungs-Peptid und Peptid relativen Häufigkeiten berechnet werden kann, die relative Häufigkeit der entsprechenden bestimmening Protein 15.
Zahlreiche quantitative Proteomik-Studien an C. reinhardtii zur Verfügung, die eine definierte Menge an Protein zu vergleichen, um Veränderungen im Proteom zwischen experimentellen Bedingungen (zB Veränderungen im Proteom durch Nährstoff 16-19 oder Lichtstress 20,21) zu analysieren. Im Vergleich zu den Studien, in der aktuell vorgestellte Ansatz gleicher Volumina der Proben werden vereinigt und analysiert. Dieser Aufbau erlaubt es, das Migrationsverhalten der Proteine innerhalb der Gradient untersuchen und darüber hinaus zur Analyse der Zusammensetzung der verschiedenen Komplexe in Bezug auf die untersuchten Stämme.
Diese Methode wird vor allem durch die Konzentration auf drei Proteine erklärt werden: Der erste Kandidat ist der Chloroplasten lokalisierten Kalzium-Sensorprotein CAS, die gezeigt wurde, in Foto-Akklimatisierung in C beteiligt werden 22 reinhardtii. Calcium wird als ein wichtiges Signalten Ionen für Wege, die durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren aktiviert werden, schließlich zu Veränderungen in der Genexpression und Zellphysiologie 23 führt, und es wurde vorgeschlagen, dass Chloroplasten könnte die zelluläre Ca 2 + Signal beitragen über die CAS-Protein 22,24,25. Das zweite Protein ANR1 (anaerobe Reaktion 1 6), ein Protein, das gezeigt wurde, unter anoxischen Bedingungen wachsen in C induziert werden, 26 reinhardtii. Bemerkenswerterweise wurden CAS sowie ANR1 als Untereinheiten des CEF-Superkomplex und darüber hinaus durch Verwendung von Reverse genetische Ansätze, wurde gezeigt, dass beide Proteine beitragen funktionell CEF in vivo 6. Unterstützung ihrer Rolle als Funktionseinheiten dieses Proteinkomplexes identifiziert. Das dritte Protein ist die Thylakoidproteintrennung PGR5-Like 1 (PGRL1), die gezeigt wurde, in CEF in Chlamydomonas 4,27 sowie 5,28 in Arabidopsis beteiligt und war auch idin der Arbeit von Iwai et al entified. 7
Wildtyp (WT) gegen (vs) eine ΔPSI 29-Stamm und weisen eine Deletion des Gens PSAB, für einen wesentlichen Photosystem I Untereinheit, die ebenfalls Teil der Kodierung dieser Ansatz durch die die Ergebnisse von zwei verschiedenen Experimenten vorgestellt CEF-Superkomplex und WT vs pgrl1 ein Knock-out-Stamm 4. Für jeden dieser Versuche die quantitative Zusammensetzung der CEF-Superkomplex zwischen einem 15 N-und 14 N-markierten Stamm wurde verglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschiedene quantitative Proteomik-Studien unter Verwendung von stabilen Isotopenmarkierung sind in den letzten Jahren veröffentlicht worden. In diesen Versuchen in der Regel zwei verschiedenen Proben verglichen werden, von denen eine Probe mit einem stabilen Isotop markiert. Danach Proteine oder Peptide, die von den beiden Proben werden in einem gleichen Verhältnis vereinigt und gemeinsam weiter verarbeitet 48. Solche Studien wollen oft definiert isoliert zellulären Kompartimenten (zB Chlo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MH dankt für die Unterstützung von der "Deutschen Forschungsgemeinschaft" (DFG). Autor Beiträge: MH entworfen Forschung; KT, JS und MT durchgeführt Forschung und analysiert die Daten, KT und MH schrieb die Zeitung.
Materials
| Chemicals | |||
| Acetic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0662 | |
| Acetone | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2300 | |
| Acetonitrile Optigrade für LC-MS | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
9340 | harmful, work with gloves see protocol text for further precautions |
| Ammonium chloride 15N | Cambridge Isotope Laboratories website: http://www.isotope.com/cil/index.cfm |
39466-62-1 | |
| Ammonium chloride 14N | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0988 | |
| Ammonium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3583 | |
| Ammonium sulfate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3598 | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Fisher Scientific website: http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex |
10041653 | |
| n-Dodecyl-β-D-maltoside | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0819 | |
| EDTA | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2937 | |
| Formic acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3858 | |
| Hepes | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3724 | |
| Magnesium chloride | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A4425 | |
| Methanol | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2954 | |
| Phosphorous acid | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A0989 | |
| Di-Potassium hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1042 | |
| Potassium di-hydrogenphosphate | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1043 | |
| Sodium hydroxide | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1551 | |
| Sucrose | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A1125 | |
| Tricine | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A3954 | |
| Tris | AppliChem webiste: http://www.applichem.com/home/ |
A2264 | |
| Trypsin (sequencing grade modified) and Trypsin buffer | Promega website: http://www.promega.de/ |
V5111 | |
| Equipment | |||
| Neboulizer (BioNeb cell disruptor) | Glas-Col website: http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75 |
||
| Centrifuge tubes (14 x 89 mm) for preparation of takahashi style gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
331372 | |
| Centrifuge tubes 25 x 89 mm for preparation of thylakoid isolation gradients |
Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
344058 | |
| Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Fuchs-Rosenthal cell couting chamber | Diagonal website: https://www.diagonal.de/ |
449/72 | |
| Homogenizer (Potter) 50 ml | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
10618242 | |
| Pistil for homogenizer | Fisherbrand website: http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand |
105252220 | |
| Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge) | Beckman Coulter website: http://www.beckmancoulter.de/ |
||
| Other | |||
| Antibodies | Agrisera website: http://www.agrisera.com/en/index.html |
References
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