La surveillance des changements dans la membrane de polarité, Membrane intégrité, et intracellulaires d'ions concentrations dans<em> Streptococcus pneumoniae</em> Utilisation des colorants fluorescents

Summary

Contrairement à celle observée pour les eucaryotes, il ya un manque d'études qui dépolarisation de la membrane de détail et de la concentration d'ions changements dans les bactéries, principalement que leur petite taille rend les méthodes conventionnelles de mesure difficile. Ici, nous avons des protocoles détaillés pour le suivi de ces événements dans le Gram-positif important agent pathogène Streptococcus pneumoniae en utilisant des techniques de fluorescence.

Abstract

Membrane dépolarisation et les flux ioniques sont des événements qui ont été largement étudiés dans des systèmes biologiques en raison de leur capacité à influer profondément fonctions cellulaires, y compris l'énergétique et des transductions de signaux. Bien que les deux méthodes fluorescentes et électrophysiologiques, y compris l'utilisation de l'électrode et patch-clamp, ont été bien développés pour mesurer ces événements dans les cellules eucaryotes, la méthodologie de mesure des événements similaires dans des micro-organismes ont prouvé plus difficile à développer en raison de leur petite taille en combinaison avec la plus complexe surface externe de la membrane des bactéries de blindage. Au cours de nos études de mort initiation à Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), nous voulions élucider le rôle des événements de la membrane, y compris les changements de polarité, l'intégrité et la concentration des ions intracellulaires. Recherche de la littérature, nous avons constaté que très peu d'études existent. D'autres chercheurs ont suivi l'absorption de radio-isotopes ou d'équilibre pour mesurer la grippe ionxes et potentiel de membrane et un nombre limité d'études, principalement dans des organismes Gram-négatifs, avaient connu un certain succès en utilisant carbocyanine ou oxonol colorants fluorescents pour mesurer le potentiel de membrane, ou le chargement des bactéries avec acétoxyméthylique cellulaire infiltrant (AM) versions d'ester de sensible aux ions colorants indicateurs fluorescents. Nous avons donc créé et optimisé les protocoles de mesure du potentiel de membrane, la rupture, et d'ions de transport dans l'organisme Gram-positif S. pneumoniae. Nous avons développé des protocoles utilisant le bis-oxonol colorant DiBAC ₄ (3) et le colorant iodure de propidium cellulaire-imperméant pour mesurer dépolarisation de la membrane et de la rupture, respectivement, ainsi que des méthodes pour charger de manière optimale le pneumocoque avec les esters AM des colorants ratiométriques Fura-2, PBFI, BCECF et à détecter des changements dans les concentrations intracellulaires de ^{Ca2 +,} K ⁺ et H ^+, respectivement, en utilisant un lecteur de plaque par fluorescence détection. Ces protocoles sont les premiers de leur genre pour le pneumocoqueet la majorité de ces colorants n'ont pas été utilisés dans d'autres espèces bactériennes. Bien que nos protocoles ont été optimisés pour S. pneumoniae, nous croyons que ces approches devraient constituer un excellent point de départ pour des études similaires dans d'autres espèces bactériennes.

Introduction

Notre laboratoire a identifié un complexe protéine-lipide à partir de lait humain nommé Hamlet (pour Human Alpha-lactalbumine Fait létale pour les cellules tumorales) qui induit l'apoptose dans les cellules tumorales, mais est également capable de tuer une variété d'espèces bactériennes ^1,2. Les espèces qui ont été jugées particulièrement sensibles sont ceux qui ciblent les voies respiratoires, avec Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque) affichant la plus grande sensibilité et un phénotype de l'apoptose comme la mort ^{de 2,3.} Événements de transport dépolarisation de la membrane et d'ions spécifique sont bien décrits et événements cruciaux lors de l'apoptose dans des cellules eucaryotes, en particulier dans les mitochondries, où TPP ⁺ ions et des colorants fluorescents, dont le JC-1 et TMRE radioactives ont été utilisées pour démontrer la dépolarisation de la membrane mitochondriale ^{3 -5.} Ainsi, nous avons cherché à en savoir plus sur l'effet de HAMLET sur ces fonctionnalités liées à la membrane dans le pneumocoque que nous avons concentré nos efforts pourdévelopper une meilleure compréhension des composants mécaniques du phénotype de l'apoptose comme les bactéries, avec un grand potentiel pour l'identification de nouveaux traitements antibactériens ou candidats vaccins dans le processus.

En cherchant à établir des protocoles pour nos études mécanistes, nous avons découvert que, contrairement à la méthodologie bien décrite dans les systèmes eucaryotes, il existe très peu d'études publiées en détail les mécanismes de la membrane bactérienne de ^6,7 électrophysiologie et de transport d'ions. Ceci est principalement attribuable à la petite taille des micro-organismes et leur architecture de surface, en particulier la présence de la paroi cellulaire, qui limite l'accessibilité de la membrane pour l'utilisation de méthodes eucaryotes classiques comme patch clamp, bien que certaines études utilisant des protoplastes géants ont été effectués avec un succès mitigé ^8,9. Comme le travail avec ces protoplastes géants n'est pas une méthode idéale ou même pratique pour la plupart des espèces bactériennes car il exige de l'hommebactéries ipulated dans un état ​​anormal et abiotique, les études limitées de polarité de la membrane bactérienne qui ont été réalisées ont principalement utilisé la cytométrie en flux et l'utilisation de cyanine et oxonol fluorescentes ^10-16.

Au lieu de la cytométrie en flux, qui rassemble les lectures de fluorescence individuels d'une bactérie à un point de temps unique, nous avons choisi d'utiliser un lecteur de plaques de détection de fluorescence pour détecter l'intensité de fluorescence des suspensions de bactéries dans un format de plaque de 96 puits au cours du temps. Cela nous a permis de traiter une population de bactéries à différents points dans le temps avec beaucoup plus de simplicité et de facilité, de contrôler la cinétique de fluorescence de l'ensemble de la population pour de longues périodes de temps, ce qui est difficile à réaliser en utilisant la cytométrie de flux. Après avoir testé une grande variété de colorants fluorescents sensibles au potentiel (y compris ceux mentionnés ci-dessus pour une utilisation avec les mitochondries), nous avons obtenu les meilleurs succès technique et pratique à l'aide de l'colorant bis-oxonol appelé DiBAC ₄ (3) (bis-(acide 1,3-dibutylbarbituric) triméthine oxonol) de surveiller les changements de polarité.

Nous avons aussi trouvé utile de surveiller simultanément les perturbations dans l'intégrité de la membrane en utilisant l'iodure de propidium (PI). Ce colorant fluorescent lors de la liaison à l'acide nucléique, mais n'est en mesure de le faire lorsque l'intégrité de la membrane bactérienne est compromise, ce qui en fait la composante populaire utilisé pour détecter les cellules mortes dans des essais vivants morts coloration. En plus de PI, SYTOX vert et TO-PRO-1 sont des colorants fluorescents qui sont similaires dans l'action et ont déjà été utilisés pour les bactéries dans quelques études utilisant la cytométrie de flux des méthodes de détection ^17. Nous avons choisi d'utiliser PI en raison de sa longueur d'onde d'excitation qui nous a permis de suivre sa fluorescence en même temps que DiBAC dans un échantillon donné.

Dans nos études, nous avons observé que HAMLET, ainsi qu'un autre complexe de protéines-lipides est associée avec une activité bactéricideconnue sous le nom ELOA, induite par la dépolarisation et la rupture de la membrane bactérienne comme indiqué par l'augmentation de la fluorescence des deux colorants lors d'un traitement de la pneumocoques ^3,18,26. Pour les deux complexes, nous avons observé que l'intensité de fluorescence de DiBAC ₄ (3) a augmenté avant l'augmentation de l'intensité de PI, ce qui indique que la dépolarisation est survenu avant la rupture et est, par conséquent, un événement spécifique induite par les complexes bactéricides protéine-lipide d' intérêt. Cette distinction est importante à faire, comme la rupture de la membrane peut se faire dépolarisation non spécifique. Cinétique mesurer et d'analyser à la fois DiBAC ₄ (3) et PI fluorescence simultanément nous a permis d'examiner cette relation entre les deux événements de la membrane, ce qui est un avantage supplémentaire de l'utilisation de la fluorimétrie à la place de la cytométrie de flux.

Pour contrôler le flux d'ions bactérienne, il ya eu un certain succès avec l'utilisation de radio-isotopes précédente, y compris la mesure de l'absorption de45 Ca ^{2 +} dans le pneumocoque ^19,20, que nous avons également utilisé dans nos études récentes ^{18, 21.} Cependant, travailler avec ces ions radioactifs présente plusieurs inconvénients. Ils peuvent être coûteux, fastidieux et salissant, et peut également exposer la personne effectuant l'expérience de nuire, en fonction de l'isotope d'intérêt. En outre, il est difficile de surveiller des changements rapides dans le temps. Ainsi, nous nous sommes tournés vers une méthode de mesure alternative qui emploie versions acétoxyméthylique (AM) d'esters de l'indicateur fluorescent colorants sensibles aux ions. Par lui-même, le colorant indicateur est chargé et ne passe pas facilement à travers la membrane, mais avec l'addition du groupe ester lipophile, la molécule non chargée peut maintenant passer à travers la membrane de la bactérie. En entrant dans l'habitacle, les estérases bactériennes cliver le groupe ester, en laissant libre le colorant à l'intérieur de la cellule et à nouveau chargé, ce qui ralentit considérablement sa capacité à sortir de la cellule et en permettant au colorant to s'accumuler à l'intérieur au fil du temps. Cependant, l'utilisation de ces colorants ester n'a été décrite que dans quelques espèces bactériennes à détecter les changements dans intracellulaire de Ca ^{2 +} et H ^{+ 22-24 16,} avec diverses méthodes de chargement, de détection et de succès.

Avec le désir de suivre l'évolution de Ca ^{2 +} intracellulaire et aussi les niveaux K ⁺ et H ⁺ dans S. pneumoniae lors du traitement avec Hamlet et d'autres composés, nous avons créé avec succès des protocoles pour charger efficacement colorants indicateurs fluorescents dans des cellules bactériennes. Chargement efficace dans des bactéries nécessaires à la fois probénécide qui augmente la rétention de colorant en bloquant d'anions transporteurs et PowerLoad, un composé exclusif de Life Technologies qui augmente l'efficacité de chargement. Fura-2/AM (détection Ca ^{2 +),} PBFI / AM (détection K ^+), et BCECF / AM (détection H ⁺⁾ ont été chargés avec succès à la fois non encapsulé et encapsulé pneumocoque stpluies permettant la mesure des motifs de fluorescence résultant après l'addition d'ionophores, tels que l'ionomycine (Ca ^{2 +} découpleur), la valinomycine (K ⁺ découpleur) et CCCP (H ⁺ découpleur) en utilisant un lecteur de plaques de détection de fluorescence ^{18, 21.}

Protocol

Une. Préparation cultures bactériennes Stimuler la culture pour une utilisation dans des expériences Dans un bloc de chauffage à 37 ° C, décongeler un stock-flacon congelé de S. pneumoniae et ajouter son contenu à 9 ml de frais, préchauffé bouillon de Todd-Hewitt avec de l'extrait de levure à 0,5% (THY) pour un volume total de 10 ml dans un tube de culture en verre. Incuber statiquement à 37 ° C jusqu'à ce que la culture atteigne la phase semi…

Representative Results

Pour toutes les expériences, il existe une série d'échantillons et les conditions présentes dans chaque puits. Ainsi, chaque tracé représente l'intensité de fluorescence d'une population entière de bactéries au cours du temps. Les résultats devraient être faciles à interpréter, avec une distinction claire entre la fluorescence des échantillons traités et que des témoins non traités. La cinétique et le degré de changement observé dans fluorescence pourraient fournir des informatio…

Discussion

Malgré la limitation de cette taille présente de en utilisant des procédés classiques d'électrophysiologie pour détecter les changements de polarité et de l'intégrité de la membrane et des changements dans les concentrations d'ions à l'intérieur des bactéries, nous avons décrit une manière de mesurer ces événements dans S. pneumoniae en utilisant des colorants fluorescents. Nos protocoles sont les premiers de leur genre décrit pour le pneumocoque et l'un des rares décrits p…

Materials

Todd Hewitt	Bacto, BD Diagnostics	249240
Yeast Extract	Bacto, BD Diagnostics	212750
Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2)	Invitrogen (GIBCO)
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879	DMSO
DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol)	Molecular Probes	B-438
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Make up in deionized water
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich
PowerLoad	Molecular Probes	P10020	100X concentrate
Probenecid	Molecular Probes	P36400	Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial
Fura-2/AM	Molecular Probes	F1221	Special packaging (50 µg aliquots)
PBFI/AM	Molecular Probes	P1267	Special packaging (50 µg aliquots)
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143
KH2PO4	JT Baker	3246-01	monobasic
K2HPO4	JT Baker	4012-01	dibasic
NaOH	JT Baker	5565-01
BCECF/AM	Molecular Probes	B1170	Special packaging (50 µg aliquots)
CCCP	Sigma-Aldrich		Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm,
			dissipating the electrical potential and the H+ gradient.
Culture tube	VWR	53283-802	Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass
Spectrophotometer	Thermo Scientific		Spectronic 20D+
15 ml plastic conical tube	Corning	430790
Clear 96-well polystyrene microtiter plate	Fisher Scientific	12-565-501
Plate reader	BioTek	Synergy 2 Multi-Mode
		Microplate Reader
Gen5 software	BioTek	Gen5™ Software