رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في<em> العقدية الرئوية</em> استخدام الأصباغ نيون
Summary
على عكس ما تشهده لحقيقيات النوى، وهناك ندرة في الدراسات التي الاستقطاب الغشاء التفاصيل وتركيز أيون التغييرات في البكتيريا، في المقام الأول وصغر حجمها يجعل الأساليب التقليدية لقياس صعوبة. هنا، ونحن البروتوكولات التفاصيل لرصد مثل هذه الأحداث في الغرام إيجابية هامة الممرض العقدية الرئوية باستخدام تقنيات مضان.
Abstract
الاستقطاب الغشاء والأيونات تدفقات هي الأحداث التي تمت دراستها على نطاق واسع في النظم البيولوجية بسبب قدرتها على التأثير بعمق الوظائف الخلوية، بما في ذلك علم الطاقة وtransductions الإشارة. في حين أن كلا أساليب الفلورسنت والكهربية، بما في ذلك استخدام القطب والتصحيح، لقط، تم متطورة لقياس هذه الأحداث في الخلايا حقيقية النواة، ومنهجية لقياس أحداث مماثلة في الكائنات الحية الدقيقة أثبتت أكثر تحديا لتطوير نظرا لحجمها الصغير في تركيبة مع أكثر تعقيدا السطح الخارجي للبكتيريا يحمي الغشاء. خلال دراساتنا من الموت الشروع في العقدية الرئوية (المكورات الرئوية)، أردنا توضيح دور الأحداث الغشاء، بما في ذلك التغيرات في قطبية، والنزاهة، وتركيزات أيون بين الخلايا. البحث في الأدب، وجدنا أن عدد قليل جدا من الدراسات وجود لها. وكان المحققون أخرى رصدها امتصاص النظائر المشعة أو التوازن لقياس انفلونزا أيونXES وغشاء المحتملة وعدد محدود من الدراسات، ومعظمها في الكائنات سالبة الجرام، قد شهدت بعض النجاح باستخدام carbocyanine أو oxonol الأصباغ الفلورية لقياس غشاء المحتملة، أو تحميل البكتيريا مع خلايا acetoxymethyl نفيذ (AM) إصدارات استر حساسة ليثيوم مؤشر الأصباغ الفلورية. لذا أنشأنا والبروتوكولات الأمثل لقياس غشاء المحتملة، وتمزق، وايون النقل في الحي إيجابية الجرام S. الرئوية. طورنا البروتوكولات باستخدام الصبغة مكرر oxonol DiBAC 4 (3) وخلايا الصبغة impermeant يوديد propidium لقياس الاستقطاب الغشاء وتمزق، على التوالي، فضلا عن أساليب لتحميل أمثل المكورات الرئوية مع استرات AM من الأصباغ ratiometric FURA-2، PBFI، وBCECF للكشف عن تغيرات في تركيزات داخل الخلايا كا 2 +، K +، وH +، على التوالي، وذلك باستخدام لوحة قارئ مضان الكشف. هذه البروتوكولات هي الأولى من نوعها لالمكورة الرئويةوغالبية هذه الأصباغ لم يتم استخدامها في أي نوع من الأنواع البكتيرية الأخرى. على الرغم وقد تم تحسين بروتوكولات لدينا S. الرئوية، ونحن نعتقد أن هذه الأساليب تشكل نقطة انطلاق ممتازة لدراسات مماثلة في الأنواع البكتيرية الأخرى.
Introduction
وقد حددت لدينا مختبر مجمع البروتين الدهني من الحليب البشري اسمه هاملت (لالإنسان ألفا ألبومين اللبن مصنوعة قاتلة للخلايا السرطانية) أن يستحث موت الخلايا المبرمج في الخلايا السرطانية، ولكن هي أيضا قادرة على قتل مجموعة متنوعة من الأنواع البكتيرية 1،2. وكانت الأنواع التي وجدت لتكون حساسة بشكل خاص تلك التي تستهدف الجهاز التنفسي، مع العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) عرض أعظم حساسية والنمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج وفاة 2،3. الأحداث النقل الاستقطاب الغشاء والأيونات محددة هي موصوفة وصفا جيدا والأحداث الحاسمة خلال موت الخلايا المبرمج في الخلايا حقيقية النواة، خاصة في الميتوكوندريا، حيث استخدمت TPP المشعة + الأيونات والأصباغ الفلورية بما JC-1 وTMRE لإثبات الاستقطاب للغشاء الميتوكوندريا 3 -5. وبالتالي، سعينا لمعرفة المزيد حول تأثير هاملت على هذه الميزات ذات الصلة في غشاء الرئوية كما ركزنا جهودنا لتطوير فهم أفضل للمكونات الميكانيكية من النمط الظاهري مثل موت الخلايا المبرمج في البكتيريا، مع إمكانات كبيرة للعلاجات المضادة للبكتيريا تحديد رواية أو اللقاحات المرشحة في هذه العملية.
في السعي لوضع بروتوكولات للدراسات الآلية لدينا، اكتشفنا أنه خلافا للمنهجية موصوفة وصفا جيدا في أنظمة حقيقية النواة، وهناك عدد قليل جدا من الدراسات التي نشرت تفاصيل آليات الكهربية والنقل ايون من 6،7 غشاء البكتيريا. ويعزى هذا أساسا إلى حجم أصغر من الكائنات الحية الدقيقة والهندسة المعمارية سطحها، وخصوصا وجود جدار الخلية، والتي تقيد الوصول للغشاء لاستخدام الأساليب التقليدية مثل حقيقية النواة لقط التصحيح، على الرغم من أن بعض الدراسات باستخدام protoplasts العملاقة وقد أجريت بدرجات متفاوتة من النجاح 8،9. كما عمل مع هذه protoplasts العملاقة ليست طريقة مثالية أو حتى العملية لمعظم الأنواع البكتيرية لأنه يتطلب رجلالبكتيريا ipulated في حالة غير طبيعية وغير الحيوية، ودراسات محدودة من بكتيريا قطبية غشاء التي تم تنفيذها قد استخدمت في المقام الأول التدفق الخلوي واستخدام cyanine وoxonol الأصباغ الفلورية 10-16.
بدلا من التدفق الخلوي، التي تجمع قراءات مضان الفردية من بكتيريا واحدة في كل نقطة زمنية واحدة، واخترنا لاستخدام قارئ لوحة مضان الكشف للكشف عن كثافة مضان من تعليق البكتيرية في شكل لوحة 96 جيدا مع مرور الوقت. هذا مكننا لعلاج السكان من البكتيريا في نقاط زمنية مختلفة مع أكبر بكثير البساطة وسهولة، وبشكل مستمر رصد حركية مضان من السكان لفترات طويلة من الزمن، وهو أمر صعب تحقيقه من خلال استخدام التدفق الخلوي. بعد اختبار مجموعة واسعة من الأصباغ الفلورية المحتملة تراعي (بما في ذلك تلك المذكورة أعلاه للاستخدام مع الميتوكوندريا)، حققنا أفضل نجاح التقنية والعملية باستخداممكرر oxonol صبغة تسمى DiBAC 4 (3) (مكرر (حمض 1،3-dibutylbarbituric) trimethine oxonol) لرصد التغيرات في قطبية.
وجدنا أيضا أنه قيمة لرصد الاضطرابات في نفس الوقت على سلامة الغشاء باستخدام يوديد propidium (PI). هذه الصبغة تتفلور عليها ملزمة لالحمض النووي، ولكن هو فقط قادرة على القيام بذلك عندما يتم المساس سلامة غشاء البكتيريا، مما يجعلها عنصرا شعبية تستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في المقايسات تلطيخ الحية ميتة. بالإضافة إلى PI، SYTOX الخضراء وTO-PRO-1 هي الأصباغ الفلورية التي تشبه في العمل، وقد سبق استخدامها للبكتيريا في عدد قليل من الدراسات التي تستخدم التدفق الخلوي طرق الكشف 17. اخترنا لاستخدام PI بسبب الطول الموجي الإثارة لأنه سمح لنا لرصد مضان لها بالتزامن مع DiBAC في عينة معينة.
في دراستنا، لاحظنا أن هاملت، فضلا عن مجمع آخر البروتين الدهني ذات الصلة مع النشاط جراثيمالمعروفة باسم ELOA، الاستقطاب الناجم عن وتمزق الغشاء الجرثومي كما يتبين من زيادات في مضان من كل من الأصباغ على علاج المكورات الرئوية 3،18،26. لكل من المجمعات، لاحظنا أن كثافة مضان من DiBAC 4 (3) زيادة قبل الزيادة في كثافة PI، مشيرا إلى أن الاستقطاب وقعت قبل تمزق، وبالتالي، حدث معين الناجمة عن لدينا المجمعات البروتين الدهني جراثيم من الفائدة. هذا التمييز مهم لجعل، وتمزق الغشاء يمكن أن يسبب الاستقطاب نفسها غير محددة. يسمح حركية قياس وتحليل كل DiBAC 4 (3) وPI مضان في وقت واحد منا لدراسة هذه العلاقة بين الحدثين الغشاء، وهي ميزة إضافية لاستخدام التألق بدلا من التدفق الخلوي.
لرصد بكتيريا تدفق أيون، كان هناك بعض النجاح السابق مع استخدام النظائر المشعة، بما في ذلك قياس امتصاص45 كا 2 + في المكورة الرئوية 19،20، ونحن قد استخدمت أيضا في دراساتنا الأخيرة 18 و 21. ومع ذلك، والعمل مع هذه الأيونات المشعة لديها العديد من السلبيات. يمكن أن يكون مكلفا، وتستغرق وقتا طويلا، والفوضى، ويمكن أيضا أن تعرض الأفراد الذين يؤدون هذه التجربة لإلحاق الضرر، اعتمادا على النظائر من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب رصد التغيرات السريعة مع مرور الوقت. وبالتالي، لجأنا نحو طريقة بديلة القياس التي تستخدم إصدارات acetoxymethyl (AM) استر من الأصباغ الفلورية مؤشر الحساسة ليثيوم. في حد ذاته، وجهت للصبغ ومؤشر لا تمر عبر الغشاء بسهولة، ولكن مع إضافة مجموعة استر محبة للدهون، يمكن للجزيء الآن بدون تهمة تمر عبر غشاء البكتيريا. عند دخول المناطق الداخلية، والاسترات البكتيرية يلتصق مجموعة استر، وترك الصبغة حرة داخل الخلية واتهم مرة أخرى، وتباطؤ كبير قدرته على الخروج من الخلية والسماح للر صبغس تتراكم داخل بمرور الوقت. ومع ذلك، فقد وصفت فقط استخدام هذه الأصباغ استر في عدد قليل من الأنواع البكتيرية للكشف عن تغيرات في الخلايا كا 2 + H + 22-24 و16، مع أساليب مختلفة من التحميل، والكشف، والنجاح.
مع الرغبة في رصد التغيرات في الخلايا كا 2 +، وكذلك + K + H والمستويات في S. الرئوية عند العلاج مع هاملت وغيرها من المركبات، أنشأنا بنجاح بروتوكولات لتحميل الأصباغ الفلورية مؤشر بكفاءة في الخلايا البكتيرية. التحميل فعالة في البكتيريا المطلوبة سواء البروبينسيد الذي يزيد احتباس الصبغة عن طريق منع أنيون النقل وPowerLoad، وهو مركب الملكية من تقنيات الحياة تؤدي إلى زيادة الكفاءة التحميل. Fura-2/AM (كشف كا 2 +)، PBFI / AM (كشف K +)، وBCECF / AM (H + كشف) تم تحميلها بنجاح في كل من unencapsulated ومغلفة المكورات الرئوية الحادي والامطار تمكين قياس أنماط مضان الناتج بعد إضافة ionophores، مثل ionomycin (كا 2 + uncoupler)، valinomycin (K + uncoupler) وCCCP (H + uncoupler) باستخدام قارئ لوحة مضان كشف 18 و 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من القيد الذي يطرح حجم واستخدام أساليب الكهربية الكلاسيكية للكشف عن تغيرات في الاستقطاب وسلامة الغشاء والتغيرات في تركيز أيون داخل البكتيريا، التي وصفناها وسيلة لقياس هذه الأحداث في S. الرئوية باستخدام الأصباغ الفلورية. بروتوكولات لدينا هي الأولى من …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (المنحة 53085)، ومؤسسة JR Oishei، وجمعية الرئة الأمريكية (المنحة RG-123721-N) لAPH، والمعاهد الوطنية للصحة (NIDCD) الزمالات F31DC011218 لEAC.
Materials
| Todd Hewitt | Bacto, BD Diagnostics | 249240 | |
| Yeast Extract | Bacto, BD Diagnostics | 212750 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS; pH 7.2) | Invitrogen (GIBCO) | ||
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | DMSO |
| DiBAC4(3) (bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol) | Molecular Probes | B-438 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Make up in deionized water |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| PowerLoad | Molecular Probes | P10020 | 100X concentrate |
| Probenecid | Molecular Probes | P36400 | Make 100X stock by adding 1 ml of PBS to one 77 mg vial |
| Fura-2/AM | Molecular Probes | F1221 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| PBFI/AM | Molecular Probes | P1267 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | |
| KH2PO4 | JT Baker | 3246-01 | monobasic |
| K2HPO4 | JT Baker | 4012-01 | dibasic |
| NaOH | JT Baker | 5565-01 | |
| BCECF/AM | Molecular Probes | B1170 | Special packaging (50 µg aliquots) |
| CCCP | Sigma-Aldrich | Protonophore that causes an influx of H+ into the cytoplasm, | |
| dissipating the electrical potential and the H+ gradient. | |||
| Culture tube | VWR | 53283-802 | Fits the Spectronic spectrophotometer; borosilicate glass |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | Spectronic 20D+ | |
| 15 ml plastic conical tube | Corning | 430790 | |
| Clear 96-well polystyrene microtiter plate | Fisher Scientific | 12-565-501 | |
| Plate reader | BioTek | Synergy 2 Multi-Mode | |
| Microplate Reader | |||
| Gen5 software | BioTek | Gen5™ Software |
References
- Hakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (17), 8064-8068 (1995).
- Hakansson, A., et al. A folding variant of alpha-lactalbumin with bactericidal activity against Streptococcus pneumoniae. Mol. Microbiol. 35 (3), 589-600 (2000).
- Hakansson, A. P., Roche-Hakansson, H., Mossberg, A. K., Svanborg, C. Apoptosis-Like Death in Bacteria Induced by HAMLET, a Human Milk Lipid-Protein Complex. PLoS One. 6 (3), (2011).
- Kohler, C., Gogvadze, V., Hakansson, A., Svanborg, C., Orrenius, S., Zhivotovsky, B. A folding variant of human alpha-lactalbumin induces mitochondrial permeability transition in isolated mitochondria. Eur. J. Biochem. 268 (1), 186-191 (2001).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (Δψ m) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8 (2), 115-128 (2003).
- Dominguez, D. C. Calcium signalling in bacteria. Mol. Microbiol. 54 (2), 291-297 (2004).
- Corratge-Faillie, C., Jabnoune, M., Zimmermann, S., Very, A. A., Fizames, C., Sentenac, H. Potassium and sodium transport in non-animal cells: the Trk/Ktr/HKT transporter family. Cell Mol. Life Sci. 67 (15), 2511-2532 (2010).
- Szabo, I., Petronilli, V., Zoratti, M. A patch-clamp study of Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta. 1112 (1), 29-38 (1992).
- Zoratti, M., Petronilli, V., Szabo, I. Stretch-activated composite ion channels in Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 168 (2), 443-450 (1990).
- Novo, D., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Accurate flow cytometric membrane potential measurement in bacteria using diethyloxacarbocyanine and a ratiometric technique. Cytometry. 35 (1), 55-63 (1999).
- Novo, D. J., Perlmutter, N. G., Hunt, R. H., Shapiro, H. M. Multiparameter flow cytometric analysis of antibiotic effects on membrane potential, membrane permeability, and bacterial counts of Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (4), 827-834 (2000).
- Shapiro, H. M. Membrane potential estimation by flow cytometry. Methods. 21 (3), 271-279 (2000).
- Shapiro, H. M. Microbial analysis at the single-cell level: tasks and techniques. J. Microbiol. Methods. 42 (1), 3-16 (2000).
- Bashford, C. L., Chance, B., Smith, J. C., Yoshida, T. The behavior of oxonol dyes in phospholipid dispersions. Biophys. J. 25 (1), 63-85 (1979).
- Suzuki, H., Wang, Z. -. Y., Yamakoshi, M., Kobayashi, M., Nozawa, T. Probing the transmembrane potential of bacterial cells by voltage-sensitive dyes. Anal. Sci. 19 (9), 1239-1242 (2003).
- Breeuwer, P., Abee, T. Assessment of the membrane potential, intracellular pH and respiration of bacteria employing fluorescence techniques. Mol. Microb. Ecol. Manual. 8, 1563-1580 (2004).
- Mortimer, F. C., Mason, D. J., Gant, V. A. Flow cytometric monitoring of antibiotic-induced injury in Escherichia coli using cell-impermeant fluorescent probes. Antimicrob. Agents Chemother. 44 (3), 676-681 (2000).
- Clementi, E. A., Marks, L. R., Duffey, M. E., Hakansson, A. P. A Novel Initiation Mechanism of Death in Streptococcus pneumoniae Induced by the Human Milk Protein-Lipid Complex HAMLET and Activated during Physiological Death. J. Biol. Chem. 287 (32), 27168-27182 (2012).
- Trombe, M. C., Laneelle, G., Sicard, A. M. Characterization of a Streptococcus pneumoniae mutant with altered electric transmembrane potential. J. Bacteriol. 158 (3), 1109-1114 (1984).
- Trombe, M. C. Characterization of a calcium porter of Streptococcus pneumoniae involved in calcium regulation of growth and competence. J. Gen. Microbiol. 139 (3), 433-439 (1993).
- Marks, L. R., Clementi, E. A., Hakansson, A. P. Sensitization of Staphylococcus aureus to Methicillin and Other Antibiotics In Vitro and In Vivo in the Presence of HAMLET. PLoS ONE. 8 (5), (2013).
- Futsaether, C. M., Johnsson, A. Using fura-2 to measure intracellular free calcium in Propionibacterium acnes. Can. J. Microbiol. 40 (6), 439-445 (1994).
- Tisa, L. S., Adler, J. Chemotactic properties of Escherichia coli mutants having abnormal Ca2+ content. J. Bacteriol. 177 (24), 7112-7118 (1995).
- Werthen, M., Lundgren, T. Intracellular Ca2+ mobilization and kinase activity during acylated homoserine lactone-dependent quorum sensing in Serratia liquefaciens. J. Biol. Chem. 276 (9), 6468-6472 (2001).
- Avery, O. T., MacLeod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. Induction of transformation by a dexoxyribonuceic acid fraction isolated from pneumococcus type III. J. Exp. Med. 79, 137-158 (1944).
- Clementi, E. A., Wilhelm, K. R., Schleucher, J., Morozova-Roche, L. A., Hakansson, A. P. A Complex of Equine Lysozyme and Oleic Acid with Bactericidal Activity against. PLoS One. . 8, (2013).
