Summary

Isolierung und Differenzierung von Th17 Naive CD4-T-Lymphozyten

Published: September 26, 2013
doi:

Summary

Mit Effektor-Funktionen deutlich von anderen T-Zell-Untergruppen, Th17-Zellen wurden zentral bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Diese in vitro-Differenzierung Th17-Protokoll bietet die Möglichkeit, festzustellen, ob naiven CD4 +-T-Lymphozyten in Th17-Zellen zu differenzieren und ihre Rolle in der Autoimmun-und Wirtsantwort weiter zu prüfen.

Abstract

Th17-Zellen sind eine eindeutige Untergruppe von T-Zellen, die gefunden wurden, Interleukin 17 (IL-17), und unterscheiden sich in Abhängigkeit von den anderen T-Zell-Subpopulationen einschließlich Th1, Th2 und regulatorischen T-Zellen. Th17-Zellen als zentrale Täter in übereifrigen entzündlichen Immunreaktionen bei vielen Autoimmunerkrankungen assoziiert entstanden. Bei dieser Methode reinigen wir T-Lymphozyten aus der Milz und den Lymphknoten von C57BL / 6 Mäusen, und fördern gereinigten CD4 + T-Zellen unter Kontrolle und Th17-induzierende Umgebung. Die Th17-induzierende Umgebung umfasst Stimulation in Gegenwart von Anti-CD3 und Anti-CD28-Antikörper, IL-6 und TGF-β. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 72 Stunden und für bis zu fünf Tage bei 37 ° C werden die Zellen anschließend für die Fähigkeit, IL-17 durch die Strömung zu erzeugen Zytometrie, qPCR und ELISAs analysiert. Th17 differenzierten CD4 + CD25-T-Zellen können genutzt werden, um weitere Aufklärung der Rolle, die Th17-Zellen bei der Entstehung und Progression von Autoimmun-und Host-de spielenfense. Darüber hinaus können Th17 Differenzierung von CD4 + CD25-Lymphozyten aus unterschiedlichen murinen Knockout / Krankheitsmodelle zu unserem Verständnis des Zellschicksals Plastizität beitragen.

Introduction

CD4 +-T-Lymphozyten (T-Zellen) spielen eine entscheidende Rolle bei der Immunsystem-vermittelte Abwehr gegen infektiöse Mikroorganismen. Umgekehrt T-Zellen sind auch eng mit dem Auftreten und Fortschreiten von Autoimmunkrankheiten wie Typ-1-Diabetes, systemischer Lupus erythematodes und rheumatoide Arthritis. CD4 +-T-Lymphozyten aktiviert werden durch eine Kombination von T-Zell-Rezeptor (TCR)-Wechselwirkungen mit verwandten Antigen / II-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC II)-Moleküle, und CD28-Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen mit B7.1/B7.2 15. Neben der Bereitstellung der TCR-Stimulation und CD28-Co-Stimulierung, Antigen-präsentierende Zellen zudem eine Zytokin-Umgebung, die den Zustand der Differenzierung von T-Lymphozyten bestimmt, und dadurch die Reaktion der T-Lymphozyten auf ein gegebenes Antigen zu lenken. Distinct Erreger / Antigen-präsentierenden Zelle Interaktionen schaffen unterschiedliche Zytokin-Umgebungen, die T-Lymphozyten nach unten neigen verschiedene Wege auf dem eli konzentriertmung des auslösenden Erregers. Leider Effektor-T-Lymphozyten-Bahnen, ursprünglich entworfen, um eindringende Krankheitserreger zu beseitigen, können irrtümlich gegen Selbst Gewebe 15 gerichtet werden. Daher ist ein besseres Verständnis der Differenzierungszustand jede unterschiedliche CD4 +-T-Zell-Untergruppe ist entscheidend für das Verständnis, wie das Gleichgewicht zwischen Eliminierung von Pathogenen und Toleranz gegenüber Selbst modulieren.

Neben der Th1, Th2 und induzierbare regulatorische T-Zellen-Differenzierungswege können naive T-Lymphozyten auch durch Cytokine auf der Th17 Bahn angetrieben werden. Während Th1-Zellen bekämpfen intrazelluläre Erreger, Th2-Zellen zu eliminieren extrazellulären Krankheitserregern und regulatorische T-Zellen (Tregs) zu minimieren Entzündungsreaktionen 1, 16; Th17-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von extrazellulären Bakterien und Pilze. Th17-Zellen sind in der Regel durch Expression der linienspezifischen Transkriptionsfaktor RORγT und Produktion von IL bezeichnet-17A, die die Aktivierung von Makrophagen und Neutrophilen 1, 7 fördert.

Th17-Zellen in Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht, und ihre zugehörigen Nagetiermodellen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass IL-23 (das erforderlich ist, um den Phänotyp zu erhalten Th17), aber nicht IL-12, war die zentrale Täter bei experimenteller Autoimmun-Enzephalitis (EAE), das Nagetier Krankheitsmodell für MS. Es wurde anschließend gezeigt, dass Kürzungen der IL-17 Produktion zu EAE Prävention 2, 6, 17 korreliert. Außerdem haben Th17 Zellen mit anderen Autoimmunerkrankungen wie Arthritis und systemischem Lupus erythematodes (SLE) 10, 16 verbunden. IL-23 p19-defiziente – / – Mäusen wurde gezeigt, dass eine sehr geringe Zahl von Th17 Zellen haben, und sind resistent gegenüber der Entwicklung der EAE nicht nur, sondern auch die Kollagen-induzierte Arthritis, ein Modell für rheumatoide Arthritis, 10, 18. Außerdem Mäuse mit neutralisierenden IL-17A Antikörper behandelt achterner das Auftreten von Kollagen-induzierter Arthritis wurden auch gefunden, um die Auflösung von Gelenkschäden 18 aufweisen. Es sei darauf hingewiesen, dass die Rolle von Th17 Zellen beim Fortschreiten der Autoimmunerkrankung bleibt, dadurch gekennzeichnet, da neuere Forschung hat auch eine schützende Rolle von Th17 Zellen in Diabetes Typ 1 9, 11 und 14 gezeigt Darmentzündung ist. Diese Studien bestätigen die Bedeutung der Th17 Differenzierung der Autoimmunität.

In-vitro-Th17 Differenzierung ist eine notwendige Methode in T-Zell-Forschung, denn es gibt mindestens zwei verwirrende Fragen, die weiterer Untersuchungen bedürfen: 1) Wie genau funktioniert IL-6 reguliert die Balance zwischen Treg und Th17 Differenzierung und 2) was sind die genauen Mechanismen hinter IL-17-induzierte Entzündungserkrankungen? Unser Verfahren verwendet CD4 + CD25-T-Zellen aus der Milz und den Lymphknoten der C57BL / 6 Maus. Es ist wichtig zu beachten, dass, obwohl es möglich ist, Th17 Differenzierung induzieren Verwendung eines unreinenBevölkerung, den Erwerb von zumindest 80% reines CD4 + CD25-T-Zellpopulation negiert Sorge der Verschmutzung und sorgt für mehr Erfolg Th17 Differenzierung Ergebnisse. Um die ordnungsgemäße Th17 Differenzierung zu erreichen, sind CD4 + CD25-T-Zellen in Gegenwart von Anti-CD3 und Anti-CD28, die Aktivierungssignale zu liefern, 1 bzw. 2 inkubiert und IL-6 und TGF-β. Obwohl berichtet wurde, dass IL-23 allein verwendet werden, um Th17 Differenzierung zu erreichen, wurde später gezeigt, dass IL-23 ist für die Stabilität des Th17 Zellpopulation notwendig, aber IL-6 und TGF-β sind für Th17 Differenzierung 3, 18, ​​19. Maus-Studien haben gezeigt, dass die IL-23-Rezeptors auf CD4 + T-Zellen exprimiert wird nur, nachdem sie mit IL-6 und TGF-β 13, 18 angeregt. Auch wird Th17 Zellen erfolgreich in Gegenwart von IL-23-blockierende Antikörper zu entwickeln, solange IL-6 und TGF-β vorhanden 18, 19 sind. Als solcher, diese Th17 Differenzierung Protokoll provIdes die geeigneten Bedingungen zu Th17 Differenzierung erfolgreich zu induzieren. Entwicklung eines besseren Verständnis der Mechanismen, die Th17 Differenzierung und IL-17 Produktion präsentieren die Chance für die Entwicklung besserer Therapien bei Autoimmunerkrankungen 13 ausgerichtet.

Protocol

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt durchgeführt. 1. Herstellung von Mischungen und Medien Sterile PBS pH 7,3 (1 l) 0,23 g NaH 2 PO 4 1,15 g Na 2 HPO 4 9,0 g NaCl Nehmen Sie Volumen mit DI-Wasser. Sterilisieren mit Autoklaven. Zellkulturmedium (100 ml) <br /…

Representative Results

Diese Th17 Differenzierung Protokoll beginnt mit der Entnahme der Milz und dem Achsel, brachialis, mesenterialen, Gebärmutterhalskrebs und inguinalen Lymphknoten. Eine Darstellung der Orte der jeweils in den Fig. 2 und 3 entnommen werden. Fig. 1 und 5 sowohl eine visuelle Darstellung der in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren. Diese Th17-Protokoll konzentriert sich auf die Differenzierung von CD4 + CD25-T-Lymphozyten-Population. Es ist…

Discussion

Hier haben wir das Protokoll, das in vitro Th17 Differenzierung zu erreichen beschrieben. Die Studie von Th17 Differenzierung wichtig ist, die Differenzierung von T-Lymphozyten in das Th17 Menge ist für die wirksame Eliminierung von menschlichen Pathogenen 13. Umgekehrt hat IL17-Produktion mit Autoimmunkrankheitsverlauf 13 in Verbindung gebracht. Das Verfahren von Th17 Differenzierung ist für viele Forschungseinstellungen, wie es zahlreiche verschiedene murine Modelle der Immunregulation…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird zum Teil durch die NIH / NCATS Klinische und Translationale Wissenschaftspreise an die Universität von Florida und TL1 TR000066 UL1 TR000064, eine Vielfalt Ergänzung von Mutter R01AI056152 Zuschuss aus dem National Institute of Health, einem BD Biosciences Reagenz Zuschuss, und der Universität unterstützt von Florida.

Materials

Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

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Cite This Article
Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

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