Summary

L'isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Published: September 26, 2013
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Summary

Avec des fonctions effectrices distinctes des autres sous-ensembles de cellules T, les cellules Th17 ont été impliqués dans l'auto-immunité centre inflammatoire. Cette vitro Th17 protocole de différenciation fournit un moyen de déterminer si les lymphocytes T CD4 + naïfs peuvent se différencier en cellules Th17, et d'examiner leur rôle dans l'auto-immunité et réponse de l'hôte.

Abstract

cellules Th17 sont un sous-ensemble distinct de cellules T qui ont été trouvées pour produire l'interleukine 17 (IL-17), et se différencient en fonction des autres sous-ensembles de cellules T, y compris Th1, Th2, et des cellules T régulatrices. cellules Th17 ont émergé comme un coupable central dans les réponses immunitaires inflammatoires associés à l'excès de zèle de nombreuses maladies auto-immunes. Dans cette méthode, nous purifions lymphocytes T de la rate et des ganglions lymphatiques de souris C57BL / 6, et stimuler les cellules T CD4 + purifiés sous contrôle et environnements Th17 induisant. L'environnement de Th17 inducteur comprend stimulation en présence d'anti-CD3 et anti-CD28, les anticorps de l'IL-6, et TGF-β. Après incubation pendant au moins 72 heures et jusqu'à cinq jours à 37 ° C, les cellules sont ensuite analysées pour la capacité de produire de l'IL-17 par cytométrie en flux, qPCR, et ELISA. cellules différenciées Th17 CD4 + CD25-T peuvent être utilisés pour élucider le rôle que jouent les cellules Th17 dans l'apparition et la progression de l'auto-immunité et de l'hôte defense. En outre, la différenciation Th17 de CD4 + CD25 des lymphocytes à partir de modèles KO / murins de maladies distinctes peut contribuer à notre compréhension du destin cellulaire plasticité.

Introduction

Lymphocytes T CD4 + (cellules T) jouent un rôle critique dans la défense immunitaire à médiation par le système contre les micro-organismes infectieux. A l'inverse, les cellules T sont également intimement associés à l'apparition et la progression des maladies auto-immunes telles que le diabète de type 1, le lupus érythémateux disséminé et l'arthrite rhumatoïde. Lymphocytes T CD4 + sont activées par une combinaison de récepteurs des cellules T (TCR) des interactions avec un antigène apparenté / complexe majeur d'histocompatibilité (CMH II) II des molécules, et des interactions récepteur CD28 avec des ligands B7.1/B7.2 15. En plus de la fourniture de la stimulation du TCR et CD28 co-stimulation, les cellules présentatrices d'antigènes offrent également un environnement de cytokines, ce qui détermine l'état du lymphocyte T de différenciation, en dirigeant ainsi la réponse du lymphocyte T à l'antigène donné. Interactions pathogène distincte / cellule présentatrice d'antigène de créer des environnements de cytokines distinctes, qui Skew lymphocytes T vers le bas voies distinctes axées sur la elimination de l'agent pathogène initiateur. Malheureusement, T voies effectrices des lymphocytes, à l'origine destinées à éliminer les pathogènes envahisseurs, peuvent être à tort dirigés contre des auto-tissus 15. Par conséquent, une meilleure compréhension de l'état de différenciation de chaque sous-ensemble distinct de cellules T CD4 + est essentielle pour notre compréhension de la façon de moduler l'équilibre entre l'élimination des agents pathogènes et la tolérance à l'auto.

En plus de la Th1, Th2, et des voies de différenciation des cellules T régulatrices inductibles, les lymphocytes T naïfs peuvent également être entraînés par des cytokines en bas de la voie Th17. Considérant que les cellules Th1 pathogènes intracellulaires combat, les cellules Th2 éliminer les agents pathogènes extracellulaires, et les lymphocytes T régulateurs (Tregs) minimiser les réactions inflammatoires 1, 16; cellules Th17 jouent un rôle important dans l'élimination des bactéries et des champignons extracellulaires. cellules Th17 sont généralement désignés par l'expression du facteur de transcription spécifique de la lignée RORγT et la production d'IL-17A, ce qui favorise l'activation des macrophages et des neutrophiles, 1 7.

cellules Th17 ont été impliqués dans plusieurs maladies auto-immunes, et leurs modèles de rongeurs associés. Par exemple, il a été démontré que l'IL-23 (qui est nécessaire pour maintenir le phénotype Th17), mais pas d'IL-12, était le coupable central dans l'encéphalite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle de rongeur de la maladie de sclérose en plaques. Il a été montré par la suite que la réduction de la production d'IL-17 sont corrélées à la prévention EAE 2, 6, 17. De plus, les cellules Th17 ont été associés à d'autres maladies auto-immunes comme l'arthrite et le lupus érythémateux disséminé (SLE) 10, 16. IL-23 p19 déficientes – / – les souris se sont révélés avoir de très faibles nombres de cellules Th17, et sont résistants au développement de l'EAE, non seulement, mais également d'arthrite induite par le collagène, un modèle pour la polyarthrite rhumatoïde 10, 18. En outre, les souris traitées avec des anticorps neutralisants de l'IL-17A à l'arrièreer l'apparition de l'arthrite induite par le collagène ont également été trouvés à avoir une résolution de l'atteinte articulaire 18. Il convient de noter que le rôle des cellules Th17 dans la progression de la maladie auto-immune reste à caractériser la recherche récente a également montré un rôle protecteur des cellules Th17 dans diabète de type 1 9, 11 et 14 de l'inflammation intestinale. Ces études confirment l'importance de la différenciation Th17 dans l'auto-immunité.

Dans la différenciation Th17 vitro est une méthode nécessaire à la recherche sur les cellules T, car il ya au moins deux questions troublantes qui nécessitent une enquête plus approfondie: 1) Comment fonctionne exactement IL-6 régulent l'équilibre entre Treg et la différenciation Th17, et 2) Quels sont les mécanismes exacts derrière l'IL-17 induit-troubles inflammatoires? Notre procédé utilise des cellules CD4 + CD25-T à partir des rates et des ganglions lymphatiques de la souris C57BL / 6. Il est important de noter que bien qu'il soit possible d'induire la différenciation Th17 utilisant un impurpopulation, l'acquisition d'au moins une CD4 pur à 80% + population de cellules CD25-T nie toute inquiétude de contamination et garantit des résultats de différenciation Th17 plus de succès. Afin d'obtenir une différenciation adéquate Th17, les cellules CD4 + CD25-T sont incubées en présence d'anticorps anti-CD3 et anti-CD28, qui fournissent des signaux d'activation, 1 et 2, respectivement, et de l'IL-6, et TGF-β. Bien qu'il ait été rapporté que l'IL-23 seule peut être utilisé pour réaliser la différenciation Th17, il a ensuite été démontré que l'IL-23 est nécessaire pour la stabilité de la population de cellules Th17, mais IL-6 et le TGF-β sont essentiels pour la différenciation Th17 3, 18, ​​19. Des études murines ont montré que le récepteur de l'IL-23 est exprimé sur les cellules T CD4 + seulement après qu'ils ont été stimulées avec de l'IL-6 et le TGF-β 13, 18. En outre, les cellules Th17 vont développer avec succès en présence d'IL-23-anticorps de blocage aussi longtemps que l'IL-6 et TGF-β sont présents 18, 19. En tant que tel, cette différenciation Th17 protocole provIDES les conditions appropriées avec succès pour induire la différenciation Th17. Développement d'une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent la différenciation Th17 et IL-17 production présenter l'opportunité pour le développement de meilleurs traitements visant à les troubles auto-immunes 13.

Protocol

Toute utilisation des animaux a été effectuée conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux. Une. Préparation des mélanges et des médias Stérile pH PBS: 7.3 (1 L) 0,23 g de NaH 2 PO 4 1,15 g de Na 2 HPO 4 9,0 g de NaCl Prendre avec de l'eau déminéralisée. Stériliser à l'autoclave. <…

Representative Results

Ce protocole de différenciation Th17 commence par le prélèvement de la rate et de la axillaire, brachiale, mésentériques, utérus, et les ganglions lymphatiques inguinaux. Une représentation de l'emplacement de chacun peuvent être trouvées dans les figures 2 et 3. Les figures 1 et 5 fois fournissent une représentation visuelle des méthodes décrites dans ce protocole. Ce protocole Th17 met l'accent sur la différenciation d…

Discussion

Ici, nous avons décrit le protocole pour obtenir la différenciation in vitro de Th17. L'étude de la différenciation Th17 est important, que la différenciation des lymphocytes T dans le sous-ensemble Th17 est essentiel pour l'élimination efficace des agents pathogènes humains 13. A l'inverse, la production IL17 a été associée à la progression de la maladie auto-immune 13. Le procédé de différenciation Th17 est applicable à de nombreux paramètres de reche…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu en partie par les NIH / NCATS clinique et translationnelle Bourses en sciences à l'Université de Floride TL1 TR000066 et UL1 TR000064, un supplément de la diversité de Parent Grant R01AI056152 de l'Institut national de la santé, un réactif subvention BD Biosciences, et l'Université de la Floride.

Materials

Reagent/Material
Sterile Polyestrene Petri Dish Fisher Scientific 0875713A 60 mm x 15 mm
autoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221
Premium Microscope Slides, Frosted Fisher Scientific 12-544-3 3″ x 1″1 mm
5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle BD Biosciences 309632
Corning 15 ml Centrifuge Tubes Sigma-Aldrich CLS430791
Nylon 40 microns Miami Aquaculture Nylon 40/26
Microtest tissue culture plate 96 well U bottom BD Biosciences 35-3077
Corning Costar 24 well cell culture plates Sigma-Aldrich CL3524
Eppendorf Tubes 1.5 ml Fisher Scientific 05-408-129
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e BD Biosciences 553057
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 BD Biosciences 553294
Mouse IL-6 Recombinant Protein eBioscience 14-8061-62
TGFbeta R&D Systems 240-B-002
Trypan blue solution 0.4 % Sigma-Aldrich 66H2364
Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 558107
APC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553035
PE Conjugated Anti-mouse CD25 eBioscience E01155-516
Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 BD Biosciences 560820
Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse BD Biosciences 51-2041AK (559311)
MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse Miltenyi Biotec 130-091-221
ABAM Cellgro 30-004-CI
RPMI Corning, Cellgro 10-040-CM
B 2-MercaptoEthanol MP Biomedical 194834 Hazardous
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909-1ML Hazardous
Brefeldin A (BFA) MP Biomedicals 159027
ELISA IL-17A Capture mAb BD Biosciences 555068
ELISA IL-17A Detection mAb BD Biosciences 555067
ELISA IL-17A Standard eBioscience 14-8171-80
IL-2 ELISA Kit BD Biosciences 555148
TMB Substrate Reagent Set BD Biosciences 555214
Equipment
autoMACS Pro Cell Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
Sorvall Legend RT+ Centrifuge ThermoScientific
Napco series 8000 WJ CO2 Incubator ThermoScientific
PTC-200 Peltier Thermal Cycler Biorad

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Cite This Article
Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin III, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naïve CD4 T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765, doi:10.3791/50765 (2013).

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