Promoção da sobrevivência e diferenciação de células-tronco neurais com fibrina e Fator de Crescimento Cocktails após Spinal Cord Injury grave
Summary
Matrizes de fibrina que contêm factores de crescimento foram utilizados para reter as células estaminais neurais enxertados em locais de completa a transecção da medula espinal. Células enxertadas encheu completamente a cavidade lesão e diferenciado em vários tipos de células neurais, incluindo neurônios que se estenderam axônios em acolhimento medula espinhal através de longas distâncias.
Abstract
Células-tronco neurais (NCCC) pode se auto-renovar e diferenciar em neurônios e células gliais. NSC transplantados pode substituir neurônios perdidos e glia após lesão medular (LM), e podem formar relés funcionais para re-conectar segmentos da medula espinhal acima e abaixo de uma lesão. Estudos anteriores de enxerto de células estaminais neurais têm sido limitados pela sobrevivência do enxerto incompleto no interior da cavidade da lesão da medula espinal. Além disso, o controle de sobrevivência do enxerto de células, diferenciação, e extensão do processo não tinha sido optimizada. Finalmente, em estudos anteriores, NSC de rato em cultura foram tipicamente relatada para se diferenciarem em células da glia, quando enxertado na medula espinal ferida, em vez de neurónios, a menos que o destino foi conduzido para um tipo de célula específico. Para tratar dessas questões, desenvolvemos novos métodos para melhorar a sobrevivência, integração e diferenciação de NSC para os locais de mesmo grave SCI. NSC foram recentemente isoladas de embriões dia 14 de medula espinhal (E14) de um transgênico Fischer 344 linhagem de ratos estável expressando fl verdeproteína uorescent (GFP) e foram incorporados numa matriz de fibrina contendo factores de crescimento; esta formulação destinada a reter as células enxertadas na cavidade lesão e apoiar a sobrevivência da célula. NSC no fator de fibrina / crescimento cocktail foram implantadas duas semanas após torácica nível 3 (T3) completos transecções da medula espinhal, evitando os períodos de pico de inflamação. Enxertos resultantes completamente preenchida a cavidade lesão e diferenciado em ambos os neurônios, que se estenderam axônios para o acolhimento da medula espinhal mais notavelmente longas distâncias, e glia. Enxertos de NSC humanas cultivadas que expressam GFP revelou resultados semelhantes. Assim, os métodos são definidos para melhorar o enxerto de células estaminais neuronais, de sobrevivência e de análise de resultados in vivo.
Introduction
A lesão medular (LM), muitas vezes danos não só tratos da substância branca que levam os sinais de e para o cérebro, mas também a matéria cinzenta central, causando perda segmentar de interneurônios e neurônios motores. A conseqüência da SCI é a perda de ambos função motora e sensorial abaixo da lesão. Infelizmente, o sistema nervoso central adulto (CNS) não regenerar-se espontaneamente, resultando em défices funcionais permanentes 1. Portanto, a reconstrução do adulto ferido medula espinhal e melhoria no motor, sensorial e função autonômica é uma meta importante da pesquisa SCI. Células-tronco neurais (NCCC), seja diretamente isolado do embrionário ou adulto CNS, são células candidatos atraentes para substituir neurônios perdidos e glia. Além disso, estas células têm o potencial para formar novos centros funcionais para restaurar a condução axonal, através de um local de lesão de 2,3.
Até o momento, não houve um esclarecimento detalhado da anatomia, electrophysiological e efeitos comportamentais da formação relé neuronal por NSC transplantadas após grave SCI. Há várias razões para isso: primeiro, NSCs ou tecido transplantado fetal CNS sobreviver mal quando enxertados em grandes cavidades lesão. Estudos anteriores mostram perda de células no início substancial, deixando grandes cavidades vazias lesão cística 4,5. Em alguns estudos, as células enxertadas seria posteriormente dividir e preencher a cavidade lesão 4,5, mas isso pode ocorrer após um atraso de dias ou semanas, e posterior enchimento local da lesão pode não ser completa ou consistente. Em segundo lugar, um sistema de rastreamento eficiente que fornece dados de som na sobrevivência celular, diferenciação / maturação, e conseqüência do transplantado NSCs faltava. A maioria dos estudos iniciais utilizados anterógrada e marcação retrógrada traçar projeções axonais de transplantes 2,3. No entanto, essas técnicas apenas parcialmente e, muitas vezes, as projeções axonais unclearly rotulados decorrentes de células enxertadas e métodos de rastreamento são subjetividadet às interferências provocadas por fugas de corante para além das células implantadas. Outros grupos utilizaram marcadores neuronais humanas específicas para rotular projeções axonal após o transplante de NSCs fetais humanos em roedor feridos medula espinhal 5,6. No entanto, nesses estudos, os xenotransplantes não consistentemente sobreviver bem. Recentemente, a entrega viral do gene GFP repórter foi utilizada para rotular NSC cultivadas 7,8. No entanto, a expressão da GFP foi muitas vezes inconsistentes e pode ser regulada para baixo 7. Recentemente, a utilização de ratinhos transgénicos ou ratos doadores de forma estável que expressam o gene repórter, GFP, ou a fosfatase alcalina da placenta humana, melhorou dramaticamente o rastreamento de transplantadas células estaminais neurais / progenitoras in vivo 9,11. Em terceiro lugar, muitos estudos indicam que, in vitro NSC rato cultivados derivados a partir de qualquer embrionário ou SNC adulto exclusivamente diferenciar em linhagens gliais quando transplantadas para o meio do adulto intacta ou lesada cor espinald 7,12,13, apesar do facto de essas células estaminais neurais são capazes de se diferenciar em ambos os neurónios e células da glia in vitro, indicando que os ambientes locais podem ditar o destino das células estaminais. Alternativamente, NSC cultivadas, especialmente os derivados de SNC adulto, pode ter propriedades defaulty intrínseca de se diferenciar em linhagens da glia in vivo 13.
Por causa das limitações discutidas acima, o nosso grupo desenvolveu recentemente um novo protocolo para melhorar embrionário rastreamento NSC, sobrevivência e diferenciação / maturação no adulto medula espinhal gravemente ferido. Resumidamente, começamos com um transgênico linha Fischer 344 consanguinidade rato estável expressando um gene repórter GFP que sustenta expressão GFP após o transplante in vivo 14. Em seguida, utilizamos NSCs recém-isoladas de dia embrionário 14 Fischer 344 medula espinhal, um estágio de desenvolvimento que mantém o potencial de gerar neurônios e células gliais. Finalmente, incorporadoNSC recém-dissociada em uma matriz de fibrina contendo fatores de crescimento 15-17 para reter as células e uniformemente distribuí-los dentro de uma grande cavidade da lesão, com o objetivo de apoiar a sobrevivência das células do enxerto, diferenciação e integração. Os enxertos foram colocados em locais de T3 transecção completa, duas semanas após a lesão medular. Estas células enxertadas preenchido de forma consistente locais transecção completa e diferenciada em neurônios abundantes que estenderam um grande número de axônios em acolhimento medula espinhal através de longas distâncias 18. Resultados semelhantes foram obtidos com enxertos de células-tronco neurais humanas cultivadas para imunodeficientes ratos 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos principais obstáculos para o transplante de NSC na lesão medular é pobre sobrevivência no centro da lesão. Quaisquer lacunas ou cavidades no local da lesão pode potencialmente reduzir ou enfraquecer a formação de relés neuronais funcionais entre axônios supraespinhais e separados segmentos da medula espinhal abaixo da lesão. Além disso, a baixa sobrevivência de NSCs enxertadas pode afectar a sua integração com o tecido hospedeiro, e, portanto, reduzir a conectividade dos neurônios enxertadas com n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Resource Rat e Centro de Pesquisa da Universidade de Missouri, Columbia, Missouri, para a prestação de ratos GFP; Neuralstem Inc. para fornecer células-tronco neurais. Este trabalho foi apoiado pela Administração dos Veteranos, NIH (NS09881), da Organização de Pesquisa Spinal canadense, a Fundação Craig H. Nielsen, eo Bernard e Anne Spitzer Charitable Trust.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
