קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה
Summary
מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים.
Abstract
תאי גזע עצביים (NSCs) יכולים עצמי לחדש ולהתמיין לתאי עצב וגליה. NSCs המושתל יכול להחליף את תאי עצב וגליה אבודים לאחר פגיעה בחוט השדרה (SCI), ויכול להיווצר ממסרים פונקציונליים להתחבר מחדש מקטעי חוט השדרה מעל ומתחת לנגע. מחקרים קודמים השתלת תאי גזע עצביים היו מוגבלים על ידי הישרדות שתל שלמה בתוך חלל נגע חוט השדרה. יתר על כן, מעקב של הישרדות תא שתל, בידול, והארכת תהליך לא היה אופטימלי. לבסוף, במחקרים קודמים, NSCs חולדה בתרבית דווחו בדרך כלל להתמיין לגליה כאשר השתיל לחוט השדרה נפגע, ולא נוירונים, אלא אם הגורל היה מונע לסוג תא מסוים. כדי לטפל בבעיות אלה, פיתחנו שיטות חדשות לשיפור ההישרדות, האינטגרציה והבחנה של NSCs לאתרים של SCI אפילו חמור. NSCs בודדו טרי מכבל עוברי יום 14 השדרה (E14) מקו יציב מהונדס פישר 344 חולדה להביע fl הירוקחלבון uorescent (GFP) והיו משובצים למטריצת הפיברין המכילה גורמי גדילה; ניסוח זה נועד כדי לשמור על תאים מורכבים בחלל הנגע ולתמוך בהישרדות תא. NSCs בקוקטייל הפיברין / גורם הגדילה הושתלו שבועיים לאחר transections השדרה החזי מלא ברמת 3 (T3) כבל, וכך להימנע מתקופות שיא של דלקת. שתלים וכתוצאה מכך מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לשני נוירונים, שהשתרעו אקסונים אל חוט השדרה המארח על פני מרחקים ארוכים להפליא, וגליה. שתלי של NSCs אדם המתורבת להביע GFP הביאו לממצאים דומים. לכן, שיטות מוגדרות לשיפור השתלת תאי גזע עצבי, הישרדות וניתוח של ממצאי in vivo.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה (SCI) לעתים קרובות נזקים לא רק שטחי חומר לבנים שנושאים אותות ומהמוח, אלא גם את החומר אפור המרכזי, גורמים לאובדן מגזרי של interneurons והנוירונים מוטוריים. התוצאה של SCI היא אובדן של שניהם מוטוריים ותפקוד חושי מתחת לנגע. למרבה הצער, המערכת למבוגרים העצבים המרכזית (CNS) לא באופן ספונטני להתחדש, וכתוצאה מליקויים תפקודיים קבועים 1. לכן, בנייה מחדש של כבל למבוגרים הפגועים בעמוד השדרה ושיפור במנוע, חושי ותפקוד אוטונומי היא מטרה חשובה של מחקר SCI. תאי גזע עצביים (NSCs), בין אם מבודדים ישירות ממערכת העצבים עובריים או מבוגר, הם תאי מועמד משכנעים להחליף תאי עצב וגליה לאיבוד. יתר על כן, התאים הללו הפוטנציאל להוות ממסרים פונקציונליים חדשים כדי לשחזר הולכה באקסון פני 2,3 אתר נגע.
נכון להיום, לא חלה הבהרה מפורטת של אנטומיים, electrophysiological והשפעות ההתנהגותיות של היווצרות ממסר עצבית על ידי NSCs המושתל לאחר SCI החמור. ישנן מספר סיבות לכך: ראשית, NSCs מושתל או רקמת מערכת העצבים המרכזית של העובר לשרוד בצורה גרועה כאשר השתילו לתוך חללי נגע גדולים. מחקרים קודמים הראו אובדן תא המוקדם משמעותי, ומשאיר חללים ריקים נגע גדול פיברוזיס 4,5. בחלק ממחקרי התאים המורכבים היו לאחר מכן להתחלק ולמלא את חלל נגע 4,5, אבל זה עשוי להתרחש באיחור של ימים עד שבועות, ומילוי אתר נגע שלאחר מכן לא יכול להיות שלם או עקבי. שנית, מערכת מעקב יעילה המספקת נתוני קול על הישרדות תאים, התמיינות / התבגרות, ותולדה של NSCs המושתל הייתה חסרה. רוב המחקרים המוקדמים מנוצלים antegrade ותיוג מדרדר לאתר את תחזיות axonal מהשתלות 2,3. עם זאת, טכניקות אלה באופן חלקי בלבד ולעתים קרובות תחזיות שכותרת לא ברור אקסון הנובעות מהתאים מורכבים, ושיטות נותב הן subjecלא לחפצים שנגרמו על ידי דליפה לצבוע מעבר לתאים המושתלים. קבוצות אחרות המשמשות סמנים עצביים ספציפיים אנושיים לתייג תחזיות אקסון לאחר ההשתלה של NSCs העוברי האנושי לחוט השדרה של מכרסמים נפצעו 5,6. עם זאת, במחקרים אלה, xenografts לא שרדה באופן עקבי היטב. לאחרונה, משלוח ויראלית של גן כתב ה-GFP שימש תווית NSCs התרבותי 7,8. עם זאת, הביטוי של GFP היה לעתים קרובות לא עקבי והוא יכול להיות למטה מוסדר 7. לאחרונה, השימוש בעכברים מהונדסים תורם או חולדות ביציבות להביע גן הכתב, ה-GFP, או phosphatase אלקליין השליה האנושי, שיפר באופן משמעותי את המעקב של תאי גזע / אבות עצביים מושתלים in vivo 9,11. שלישית, כמה מחקרים מצביעים על כך NSCs חולדה בתרבית במבחנה הנגזר ממערכת העצבים המרכזית או עובריים או מבוגר לבדל באופן בלעדי לשושלות גליה כאשר מושתלים לתוך המילייה של cor השדרה המבוגר ללא פגע או הפצועד 7,12,13, למרות העובדה שתאי גזע העצביים אלה הם מסוגלים להבדיל לשני תאי עצב וגליה במבחנה, מצביעים על כך שהסביבה מקומית עשויה להכתיב את גורלם של תאי גזע. לחלופין, NSCs התרבותי, במיוחד אלה הנגזרים ממערכת העצבים המרכזית למבוגרים, עשוי להיות נכס מהותי defaulty להתמיין לשושלות גליה in vivo 13.
בגלל המגבלות שנדונו לעיל, הקבוצה שלנו לאחרונה פיתחה פרוטוקול חדש כדי לשפר את המעקב עוברי המל"ל, הישרדות, ובידול / התבגרות בחוט השדרה המבוגר נפצע באורח קשה. בקצרה, התחלנו עם קו פישר 344 משפחת מזדווגים עכברים הטרנסגניים יציב להביע גן כתב ה-GFP שמקיים ביטוי של GFP לאחר השתלת in vivo 14. בשלב הבא, אנחנו משמשים NSCs המבודד טרי מיום עוברי 14 344 חוט השדרה פישר, שלב התפתחות ששומר על הפוטנציאל ליצירת שני תאי עצב וגליה. לבסוף, אנו מוטבעיםNSCs טרי ניתק לתוך מטריצת הפיברין המכילה צמיחת גורמי 15-17 כדי לשמר את התאים ובאופן שווה להפיץ אותם בתוך חלל נגע גדול, במטרה לתמוך בהישרדות תא שתל, גזירה ואינטגרציה. שתלי הונחו לתוך אתרים של חיתוך רוחב מלא T3, שבועיים לאחר פגיעה בחוט השדרה. תאים מורכבים אלה מולא באופן עקבי באתרי חיתוך רוחב מלאים ומובחנים לנוירונים בשפע שהשתרעו מספר גדול של אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים 18. תוצאות דומות התקבלו באמצעות שתלים של תאי גזע עצביים אנושיים בתרבית לחולדות חיסונית לקוי 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד המכשולים העיקריים להשתלה המל"ל בחוט השדרה נפגע הוא הישרדות עניות במרכז הנגע. כל פערים או חללים באתר הנגע העלול להפחית או להחליש את היווצרות של ממסרים עצביים פונקציונליים בין האקסונים supraspinal ומגזרים בחוט השדרה נפרדים מתחת לפציעה. בנוסף, הישרדות ירודה של NSCs מורכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למשאב לעכברוש ומרכז מחקר, אוניברסיטת מיזורי, קולומביה, מיזורי, למתן חולדות GFP; Neuralstem בע"מ לאספקת תאי גזע עצביים של אדם. עבודה זו נתמכה על ידי המינהל הוותיקים, NIH (NS09881), מנהל מחקר בעמוד השדרה בקנדה, קרן קרייג ח נילסן, וברנרד וקרן הצדקה אן שפיצר.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
References
- Ramon y Cajal, S. In Degeneration and regeneration of the nerve system. , (1991).
- Jakeman, L. B., Reier, P. J. Axonal projections between fetal spinal cord transplants and the adult rat spinal cord: a neuroanatomical tracing study of local interactions. J Comp Neurol. 307, 311-334 (1991).
- Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6, 103-121 (1999).
- Theele, D. P., Schrimsher, G. W., Reier, P. J. Comparison of the growth and fate of fetal spinal iso- and allografts in the adult rat injured spinal cord. Exp Neurol. 142, 128-143 (1996).
- Giovanini, M. A., Reier, P. J., Eskin, T. A., Wirth, E., Anderson, D. K. Characteristics of human fetal spinal cord grafts in the adult rat spinal cord: influences of lesion and grafting conditions. Exp Neurol. 148, 523-543 (1997).
- Wictorin, K., Björklund, A. Axon outgrowth from grafts of human embryonic spinal cord in the lesioned adult rat spinal cord. Neuroreport. 3, 1045-1048 (1992).
- Vroemen, M., Aigner, L., Winkler, J., Weidner, N. Adult neural progenitor cell grafts survive after acute spinal cord injury and integrate along axonal pathways. Eur J Neurosci. 18, 743-751 (2003).
- Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23, 313-324 (2005).
- Lepore, A. C., Fischer, I. Lineage-restricted neural precursors survive, migrate, and differentiate following transplantation into the injured adult spinal cord. Exp Neurol. 194, 230-242 (2005).
- Gaillard, A., et al. Reestablishment of damaged adult motor pathways by grafted embryonic cortical neurons. Nat Neurosci. 10, 1294-1299 (2007).
- Remy, S., et al. New lines of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy. Transgenic Res. 19, 745-763 (2010).
- Cao, Q. L., et al. Pluripotent stem cells engrafted into the normal or lesioned adult rat spinal cord are restricted to a glial lineage. Exp Neurol. 167, 48-58 (2001).
- Mothe, A. J., Kulbatski, I., Parr, A., Mohareb, M., Tator, C. H. Adult spinal cord stem/progenitor cells transplanted as neurospheres preferentially differentiate into oligodendrocytes in the adult rat spinal cord. Cell Transplant. 17, 735-751 (2008).
- Bryda, E. C., Pearson, M., Agca, Y., Bauer, B. A. Method for detection and identification of multiple chromosomal integration sites in transgenic animals created with lentivirus. Biotechniques. 41, 715-719 (2006).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Grumbles, R. M., Sesodia, S., Wood, P. M., Thomas, C. K. Neurotrophic factors improve motoneuron survival and function of muscle reinnervated by embryonic neurons. J Neuropathol Exp Neurol. 68, 736-746 (2009).
- Kadoya, K., et al. Combined intrinsic and extrinsic neuronal mechanisms facilitate bridging axonal regeneration one year after spinal cord injury. Neuron. 64, 165-172 (2009).
- Lu, P., et al. Long-distance growth and connectivity of neural stem cells after severe spinal cord injury. Cell. 150, 1264-1273 (2012).
- Coumans, J. V., et al. Axonal regeneration and functional recovery after complete spinal cord transection in rats by delayed treatment with transplants and neurotrophins. J Neurosci. 21 (23), 9334-9344 (2001).
- Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing e18 cortical rat neurons for compartmentalization in a microfluidic device. J Vis Exp. (305), (2007).
- Yan, J., et al. Extensive neuronal differentiation of human neural stem cell grafts in adult rat spinal cord. PLoS Med. 4 (2), e39 (2007).
- Popovich, P. G. Building bridges for spinal cord repair. Cell. 150 (6), 1105-1106 (2012).
- Catelas, I. Fibrin. Comprehensive Biomaterials. 2, 303-328 (2011).
- Petter-Puchner, A. H., et al. The long-term neurocompatibility of human fibrin sealant and equine collagen as biomatrices in experimental spinal cord injury. Exp Toxicol Pathol. 58, 237-245 (2007).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Deister, C., Schmidt, C. E. Optimizing neurotrophic factor combinations for neurite outgrowth. Journal of Neural Engineering. 3, 172-179 (2006).
