항생 물질 규제 세포주 특히 수지상 세포를 대상으로 높은 titer의 렌티 바이러스 벡터를 생성
Summary
여기, 우리는 레트로 바이러스 전달 및 테트라 사이클린의 부재 렌티 바이러스 벡터 (LV)의 구성 요소를 표현할 수있는 세포 라인을 만들 수 concatemeric 형질을 사용합니다. 이 LV는 GFP를 인코딩 및 수지상 세포 수용체 특정 당 단백질, SVGmu로 pseudotyped 있습니다.
Abstract
렌티 바이러스 벡터 (정맥 주사)는 세포의 여러 유형에 유전 물질을 전달하는 강력한 수단입니다. 정맥 주사의 대량 생산이 HIV-1 유래 벡터와 관련된 안전 문제 때문에하는 것은 도전이다. 본 논문에서, 우리는 자기 불활 정맥 주사의 높은 역가를 생산하는 방법을보고합니다. 우리는 retrovirally 돌기 세포 특정 당 단백질, SVGmu 포함한 모든 바이러스 구성 요소를 표현할 수있는 세포주, GPRS를, 생성하는 TET 오프 안정적인 생산 세포주 GPR를 형질 도입. 다음, 우리는 LV 전송 플라스미드 인코딩에게 선택 마커와 함께 리포터 유전자 GFP를 형질을 concatemeric DNA의 형질 전환을 사용합니다. 결과 클론 중 일부는 우리가 일시적인 형질로 얻을 수있는 것보다 10 배 더 큰 역가에 LV를 생성 할 수 있습니다. 또한, 이러한 바이러스를 효율적으로 체외에서 수지상 세포를 형질 도입하고 기자 항원에 강한 T 세포 면역 반응을 생성합니다. 이 방법은 좋은 옵션을 구경 할 수 있습니다R 암 또는 감염성 질환의 임상 연구에 대한 강력한 LV-기반의 백신을 생산.
Introduction
많은 벡터 시스템은 유전자 전달을 위해 개발되었습니다. 렌티 바이러스에 기반 벡터는 가장 일반적으로 공부 바이러스 시스템 사이에 있었다. 그들이 효율적으로 세포 1 분할 및 비 나누어 모두 형질 도입으로 인해 호스트 게놈에 통합 장기적인 표현을 달성, 대부분의 인간 집단이 낮은 천연 안티 – 벡터 내성을 전시하고, 대한 낮은 가능성을 가질 수 있기 때문에 이러한 벡터 유익하다 insertional 돌연변이 3,4에서 유전 독성.
렌티 바이러스의 생산은 항상 안전에 대한 우려로 채색되어 있습니다. 렌티 바이러스 벡터는 일반적으로 HIV-1, AIDS의 원인균 에이전트에서 파생됩니다. lentivector의 개별 구성 요소 (전송, 봉투, 포장 플라스미드)의 일시적인 형질 실험실 설정에서 유전 물질을 전달하는 일반적이고 유연한 방법입니다. 그러나 임상 응용을위한 확장까지 과도의 transfections는 복잡하고 엄마입니다y를 복제 능력 렌티 5,6의 발전으로 이어질. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 몇몇 안정 포장 및 생산 세포주는 6-11 개발되었다. 이 라인 중 하나 GPR 포장 라인 (11)은 테트라 사이클린에 의해 규제되는 매력적인 장점이 있습니다. 본 논문에서, 우리는 구체적으로 돌기 세포 (DC-정맥 주사) 12를 대상으로하는 자체 운영을 중지시키지 렌티 바이러스 벡터를 생산하는이 시스템을 적용하는 방법을 보여줍니다.
돌기 세포 (DCS)는 면역 시스템의 가장 강력한 항원 제시 세포입니다. 그들이 직접 프로그램을 시작하고, 종양 특이 면역 반응하기 13 규제 때문에 그들은 암 백신 개발에 큰 관심의 대상이되고있다. DC의 펩타이드 또는 DNA 백신보다 더 강력한 항암 면역 반응을 유도 할 수있는 잠재력을 포함하는 예방 접종 프로토콜을 통합. 최근에, 우리는 렌티 바이러스 벡터를 개발 한 specifically를 수정 sindbis 바이러스 당 단백질, SVGmu 14을 통해 수지상 세포를 대상으로합니다. 그들은 돌기 세포에 높은 특이성을 보여 비특이적, VSVg-pseudotyped 벡터보다 강한 면역 반응을 생성하는 이러한 벡터는 고유합니다.
여기, 우리는이 DC-타겟 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을보고합니다. 우리는이 DC-LV를이 수지상 세포를 감염하고 강력한 CD8 + T 세포의 면역 반응을 생성 할 수 보여줍니다. 동물과 관련된 모든 절차는 USC Intitutional 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 인도적으로 수행되었다. 생체 및 임상 실험을 수행하기 위해서는, 그것은 높은 역가에 바이러스를 생성 할 수 세포 라인을 만드는 것이 중요합니다. 설명대로 전달과 형질 전환 단계를 수행하면 이러한 복제를 생성하는 기회를 극대화하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 안정적으로 규제 시스템의 전원 TET 아래의 모든 렌티 바이러스 구성 요소와 형질 293T 세포를 사용하여 렌티 바이러스 벡터의 대량 생산을위한 방법을 설명했다. 지금까지, 렌티 바이러스 벡터를 생산하는 대부분의 프로토콜 (예를 들어, 18 참조) 표준 인산 칼슘 일시적인 형질 전환에 의존하고 있습니다. 이 방법은 임상 척도에 성공했습니다,하지만 안정적인 세포 라인에서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 원고에 대한 데이터를 기여 마이클 추, 빙빙 다이, 그리고 리앙 샤오를 인정하고 싶습니다. 우리는 또한이 연구에 사용 된 시약의 관대 선물 닥터 존 그레이을 인정합니다. PB는 국립 암 센터에서 박사 친교에 의해 지원됩니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소 (R01AI68978, P01CA132681 및 RCA170820A), 빌과 멜린다 게이츠 재단, 번역 의학 합동 센터에서 번역 가속 그랜트와 캘리포니아 HIV / AIDS에서 부여에서 부여에서 교부금에 의해 지원되었다 연구 프로그램.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
| Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
References
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene therapy with viral vectors. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43, 413-439 (2003).
- Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nat. Biotechnol. 24, 687-696 (2006).
- Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J. Clin. Invest. 119, 964-975 (1172).
- Hu, B., Tai, A., Wang, P. Immunization delivered by lentiviral vectors for cancer and infectious diseases. Immunological Reviews. 239, 45-61 (2011).
- Broussau, S., et al. Inducible packaging cells for large-scale production of lentiviral vectors in serum-free suspension culture. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 500-507 (2008).
- Cockrell, A. S., Ma, H., Fu, K., McCown, T. J., Kafri, T. A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 14, 276-284 (2006).
- Ikeda, Y., et al. Continuous high-titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology. 21, 569-572 (2003).
- Kafri, T., van Praag, H., Ouyang, L., Gage, F. H., Verma, I. M. A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of Virology. 73, 576-584 (1999).
- Strang, B. L., et al. Human immunodeficiency virus type 1 vectors with alphavirus envelope glycoproteins produced from stable packaging cells. Journal of Virology. 79, 1765-1771 (2005).
- Throm, R. E., et al. Efficient construction of producer cell lines for a SIN lentiviral vector for SCID-X1 gene therapy by concatemeric array transfection. Blood. 113, 5104-5110 (2009).
- Lee, C. L., Chou, M., Dai, B., Xiao, L., Wang, P. Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination. Biotechnol. Bioeng. 109, 1551-1560 (2012).
- Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, 419-426 (2007).
- Yang, L., et al. Engineered lentivector targeting of dendritic cells for in vivo immunization. Nature Biotechnology. 26, 326-334 (2008).
- Hanawa, H., et al. Efficient gene transfer into rhesus repopulating hematopoietic stem cells using a simian immunodeficiency virus-based lentiviral vector system. Blood. 103, 4062-4069 (2004).
- Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4518-4523 (2005).
- Dai, B., et al. HIV-1 Gag-specific immunity induced by a lentivector-based vaccine directed to dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20382-20387 (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J. Vis. Exp. (63), e4031 (2012).
- Kochan, G., Escors, D., Stephenson, H., Breckpot, K. Clinical Grade Lentiviral Vectors. Lentiviral Vectors and Gene Therapy. , 69-85 (2012).
- Loew, R., et al. A new PG13-based packaging cell line for stable production of clinical-grade self-inactivating gamma-retroviral vectors using targeted integration. Gene Ther. 17, 272-280 (2010).
- Gaspar, H. B., et al. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency by use of a pseudotyped gammaretroviral vector. Lancet. 364, 2181-2187 (2004).
- Cornetta, K., et al. Replication-competent lentivirus analysis of clinical grade vector products. Molecular Therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 557-566 (2011).
- Stewart, H. J., et al. A stable producer cell line for the manufacture of a lentiviral vector for gene therapy of Parkinson’s disease. Human Gene Therapy. 22, 357-369 (2011).
- Coroadinha, A. S., et al. Retrovirus producer cell line metabolism: implications on viral productivity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1125-1135 (2006).
