这里,我们用逆转录病毒转导和concatemeric的转染建立的细胞系中能表达的慢病毒载体(LV)的组件在没有四环素。此LV编码绿色荧光蛋白是一种糖蛋白,SVGmu,这是具体的树突状细胞上的受体与假。
慢病毒载体(逻辑卷)是许多类型的细胞提供遗传材料的有力手段。由于相关的安全问题与这些HIV-1的衍生载体,产生大量的LVS是具有挑战性的。在本文中,我们报道了一种用于生产高滴度自我失活LVS的。逆转录病毒转导的tet过稳定线GPR生产细胞产生的细胞系,GPRS,它可以表示所有的病毒组分,包括树突状细胞特异性糖蛋白,SVGmu。然后,我们使用concatemeric的LV的转移质粒编码DNA转染,转染报道基因GFP的组合用一个可选择的标记。得到的克隆可以制作LV上面滴度大于10倍的我们实现与瞬时转染的。另外,这些病毒高效转染树突状细胞在体外和产生强烈的T细胞免疫反应向本报记者抗原。这种方法可能是一个不错的选择FOŗ强LV为基础的疫苗,癌症或传染病的临床研究。
已经开发了许多载体系统的基因传递。基于慢病毒载体已跻身研究最常用的病毒系统。这些载体是有利的,因为他们可以高效转染分裂和非分裂细胞1,由于整合到宿主基因组实现长期表达,表现出低的天然抗载体在大多数人群的免疫力,并具有低潜力从插入突变3,4的遗传毒性。
慢病毒的生产安全问题一直着色。慢病毒载体一般是来自于HIV-1,艾滋病的病原体。单个元件的慢病毒(转让,外壳和包装质粒)的瞬时转染是一种常见的和灵活的方法,在实验室设置中提供的遗传物质。然而,扩大规模的临床应用瞬时转染是繁琐和马的Ÿ导致复制能力的慢病毒5,6的发展。要克服这些障碍,稳定的包装和生产细胞系已开发6-11。这些线路之一,探地雷达的包装生产线11,受四环素有吸引力的优势。在本文中,我们将演示如何适应这种系统产生自我失活的慢病毒载体,是专门面向树突状细胞(DC-LVS)12。
树突状细胞(DC)是最强大的抗原呈递细胞的免疫系统。他们已经在癌症疫苗开发的主题极大的兴趣,因为它们直接启动,程序和规范肿瘤特异性免疫反应13。装有包括区议会有可能引出更强的抗肿瘤免疫反应比肽或DNA疫苗的接种方案。最近,我们已经开发出一种慢病毒载体,specificallÝ针对树突状细胞,通过修改辛德毕斯病毒糖蛋白,SVGmu 14。这些载体是独特的,他们表现出高特异性树突状细胞,并产生更强的免疫反应比特异性,VSVG假型载体。
在这里,我们报告的方法产生大量的这些直流针对性的慢病毒载体。我们表明,这些DC-LVS可以感染区议会和产生强烈的CD8 + T细胞的免疫反应。所有程序涉及动物的人道待遇,执行下USC Intitutional动物护理和使用委员会批准。为了执行在体内和临床实验,这是至关重要的建立的细胞系,可以制作高滴度的病毒。执行转导和转染与所述的相同的步骤,将产生这样的克隆的机会最大化。
在这里,我们已经提出了一个方法生产大量使用慢病毒载体293T细胞稳定转关监管制度下TET所有慢病毒组件。至目前为止,大多数协议产生慢病毒载体依赖于标准的磷酸钙瞬时转染(见18)。这种方法已成功地在一个临床范围,但它可能遭受的一些限制,不太可能是存在于扩大生产的稳定细胞株。例如,与大量的LV质粒的共转染理论上可以增加复制能力的慢病毒19的发展机会。此外?…
The authors have nothing to disclose.
笔者想承认迈克尔·周,戴冰冰,梁萧此稿件提供数据。我们也承认约翰·格雷博士在这项研究中所使用的试剂厚礼。 PB是由国立癌症中心博士后奖学金支持。这项研究是由来自美国国立卫生研究院(R01AI68978 P01CA132681 RCA170820A),比尔和梅林达·盖茨基金会,平移加速转化医学联合中心和加州艾滋病毒/艾滋病的资助赠款的资助拨款研究计划。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
Glutamine | Mediatech Inc. | 25-005-Cl | |
Doxycycline | Clontech Laboratories, Inc. | 631311 | |
Zeocin | Invitrogen | R250-01 | Toxic |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |