Summary

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Published: June 19, 2013
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Summary

Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.

Abstract

Untersuchungen der zellulären Pathogenese pathogener Hefen wie Candida albicans, Histoplasma capsulatum und Cryptococcus neoformans verwenden üblicherweise Infektion von Säugetier-Hosts oder Wirtszellen (zB Makrophagen) durch Hefe Quantifizierung mittels koloniebildende Einheit Analyse oder Durchflusszytometrie gefolgt. Während koloniebildende Einheit Aufzählung ist das am häufigsten verwendete Verfahren auf dem Gebiet hat diese Technik Nachteile und Beschränkungen, einschließlich der langsamen Wachstum einiger Pilzarten auf festen Medien und nieder-und / oder variable Beschichtung Wirkungsgrade, die von besonderer Bedeutung ist bei einem Vergleich Wachstum von Wildtyp-und Mutanten. Durchflusszytometrie können schnelle quantitative Informationen über Hefelebensfähigkeit bieten hat jedoch Verabschiedung durchflusszytometrischen Nachweis für pathogene Hefen für eine Reihe von praktischen Gründen, einschließlich seiner hohen Kosten und die biologische Sicherheit Überlegungen beschränkt. Hier zeigen wir eine bildbasiertecytometric Methodik mit der Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) für die Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen in Co-Kultur mit Makrophagen. Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.:. Unsere Studien auf dem Nachweis von zwei menschlichen Pilzpathogene konzentrieren capsulatum kolonisiert Alveolarmakrophagen durch die Replikation innerhalb der Makrophagen phagosome, und hier haben wir quantitativ das Wachstum von H. capsulatum Hefen in RAW 264.7 Makrophagen mit Acridinorange / Propidiumiodidfärbung in Kombination mit Bildzytometrie. Unsere Methode treu rekapituliert Wachstumstrends wie durch traditionelle Kolonie bildende Einheit Aufzählung gemessen, aber mit deutlich erhöhter Empfindlichkeit. Zusätzlich haben wir direkt beurteilen Infektion von lebenden Makrophagen mit einem GFP-exprimierenden Stamm von C. albicans. Unsere Methodik bietet eine schnelle, genaue und kostengünstige Mittel zur Detektion und Quantifizierung von wichtigen menschlichen pilzliche Erreger in Verbindung with Wirtszellen.

Introduction

Studien von pathogenen Pilzen in Verbindung mit ihren Gastgebern und / oder Wirtszellen erfordern oft Quantifizierung der lebensfähigen Pilzzellen über einen Zeitverlauf oder unter verschiedenen Bedingungen Infektion. Zählung der koloniebildenden Einheiten (CFU) der Standard-Methode, durch die die Zahl der lebensfähigen Pilzzellen gemessen wurde, jedoch hat dieses Verfahren einige Nachteile und Einschränkungen. Erstens sind viele Pilzarten langsam wachsende. Das Wachstum der sichtbaren Kolonien auf festen Medien kann 1-2 Wochen, deutlich verlangsamt das Tempo der Forschung. Zweitens ist Manipulation von Proben während der CFU Beschichtung ein langwieriger Prozess, da mehrere Verdünnungen müssen beschichtet, um eine zählbare Anzahl der Kolonien zu gewährleisten. Drittens, ist die Anzahl der CFU typischerweise geringer als die Zahl von lebensfähigen Organismen, weil die Beschichtung überzogen Wirkungsgrad deutlich unter 100%. Zum Beispiel kann Plattieren Wirkungsgrade für die dimorphic Pilzpathogen Histoplasma capsulatum so hoch wie 90%, aber routinemäßig so niedrig wie30% und sogar noch niedriger (10%) für die entsprechende Pilz dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Plating Effizienz für Candida albicans ist auch Gegenstand Variabilität 3. Schließlich entfallen CFU Analyse für nur leben und sich aktiv teilenden Zellen, die zur Festlegung Wachstum auf festen Medien, wobei in vielen Situationen, wäre es nützlich, um die Anwesenheit und Konzentration von toten und / oder metabolisch inaktiven Zellen zu bestimmen.

Zuvor hat durchflusszytometrischen Methoden zur Quantifizierung von mehreren pathogenen Pilzarten wurden 4-6 beschrieben. Doch aufgrund Biosicherheit Containment Probleme bei der Verwendung Sicherheitsstufe 2 (BSL2) oder BSL3-Level Krankheitserreger auf gemeinsamen Durchflusszytometern beteiligt hat Annahme dieser Technik beschränkt. Wie Durchflusszytometrie ist Bildzytometrie eine sensible und schnelle Methode der Zelle Quantifizierung. Allerdings kann Bildzytometrie zu einem Bruchteil der Kosten mit vergleichbaren Ergebnissen 7 durchgeführt werden 11. Hier beschreiben wir Verfahren zur Durchführung Bildzytometrie von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen. Wir demonstrieren unsere Methoden mit zwei menschlichen Pilzpathogene: Histoplasma capsulatum und Candida albicans H.. capsulatum ist ein dimorphic Pilzpathogen, die Erkrankung der Atemwege verursacht, in den Menschen, es wächst wie Bäckerhefe und repliziert in Alveolarmakrophagen Candida albicans ist ein Mensch kommensalen Arten, die gelegentlich verursacht Candidiasis.. Wir zeigen, dass Bildzytometrie schnelle Quantifizierung dieser Hefen ermöglicht, zusammen mit Visualisierungsmöglichkeiten.

Protocol

1. Die Infektion von Makrophagen mit H. capsulatum, C. albicans 16 Stunden vor der Infektion, Samen Makrophagen an gewünschten Dichte in 24-Well-Platten. In diesem Protokoll wurde eine Dichte von 3,0 x 10 5 Zellen / Vertiefung verwendet. In Pilzzellen in log-Wachstumsphase bei einer gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI). Dieses Protokoll bietet Platz für eine Reihe von MOI (0,2-5,0). Für die Infektion von Makrophagen mit RAW264.7 H. capsulatum, verwendeten w…

Representative Results

Wir nutzten die Cellometer Bild Anblick cytometer um das Wachstum von H. überwachen capsulatum in Makrophagen. RAW 264.7 Zellen wurden mit H. infiziert capsulatum Hefezellen und zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben AO / PI-Färbung von bildbasierten durchflusszytometrische Analyse, unterzogen. Parallel dazu wurden Proben von traditionellen CFU Aufzählung analysiert. Zu jedem Zeitpunkt wurden die Proben in Wasser inkubiert, um Makrophagen zu lysieren und die freigesetzte Hefeze…

Discussion

Bildzytometrie ermöglicht es dem Benutzer, um qualitativ hochwertige Bilder zu erfassen und mit spezieller Software, führen Sie eine schnelle Quantifizierung von Zellen. Eine mögliche Herausforderung für die Annahme Bildzytometrie im Bereich der mikrobiellen Pathogenese ist, dass die Mikroorganismen zu zählen, die in einer gemischten Population von Zellen, einschließlich Säuger-Wirtszellen sind. Hier zeigen wir, dass Bildzytometrie zur Quantifizierung von lebensfähigen pathogenen Hefen während der in vitro-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

REAGENTS
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000044
AO/PI Solution Nexcelom Bioscience CSK-0102
Disposable Counting Chamber Nexcelom Bioscience CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software Nexcelom Bioscience

References

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Cite This Article
Berkes, C., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells. J. Vis. Exp. (76), e50599, doi:10.3791/50599 (2013).

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