使用的细胞图像分析仪量化致病真菌与宿主细胞协会
Summary
在这里，我们将演示如何图像流式细胞仪可用于量化致病真菌与宿主细胞培养。 CFU枚举作为一种替代，可以使用这种技术。
Abstract
如白色念珠菌 ， 荚膜组织胞浆菌 ， 隐球菌致病酵母细胞发病机制的研究通常采用感染的哺乳动物宿主或宿主细胞（ 如巨噬细胞），然后由酵母定量用集落形成单元分析或流式细胞仪。虽然菌落形成单位枚举在该领域一直是最常用的方法，这种技术的缺点和局限性，包括在固体培养基上，低和/或可变电镀效率，这是比增长时，特别关注一些真菌物种增长缓慢野生型和突变株。流式细胞仪可以提供快速定量有关酵母活力，然而，采用流式细胞仪检测致病性酵母菌已为一些现实的原因，包括其成本高和生物安全方面的考虑限制。在这里，我们展示了一个基于图像使用流式细胞仪的方法Cellometer视觉（Nexcelom生物科技有限责任公司）与巨噬细胞共培养的量化可行的致病性酵母菌。我们的研究集中在两个人的真菌病原体检测： 组织胞浆菌和白色念珠菌。H.荚膜殖民肺泡巨噬细胞通过复制内巨噬细胞的吞噬体，在这里，我们定量评估H.增长荚膜酵母在RAW 264.7巨噬细胞用吖啶橙/碘化丙啶染色结合图像分析。我们的方法忠实地概括增长趋势作为衡量传统的菌落形成单位枚举，但显着增加灵敏度。此外，我们直接评估感染活的巨噬细胞与GFP表达菌株C.白色念珠菌 。我们的方法提供了一种快速，准确和经济的手段，重要关联机智的人类病原真菌的检测和定量h主机细胞。
Introduction
超过一个时间过程或不同的感染条件下，在与主机和/或宿主细胞的致病性真菌的研究经常需要量化的活的真菌细胞。枚举的菌落形成单位（CFU）是活的真菌细胞的数目已被测量的标准方法，通过它，但是，这种技术具有一些缺点和限制。首先，许多真菌物种生长缓慢。可见固体培养基上菌落增长需要1-2周，研究的步伐显着放缓。二，操纵在CFU电镀过程中的样品是一个费力的过程中，由于必须镀几个稀释度，以确保可数的菌落数。第三，CFU的数目通常低于镀活的微生物的数量，因为电镀效率低于100％。例如，二相性真菌病原体荚膜组织胞浆菌的电镀效率可高达90％，但常规低至30％，甚至更低（10％），为相关的真菌双晶片Paracoccidioides巴西 1，2。 白色念珠菌的电镀效率也受到变异3。最后，CFU分析占活和细胞分裂的活性，能够建立在固体培养基上的生长，而在许多情况下，这将是有用的，以确定是否存在和浓度的的死和/或代谢的非活动单元。
以前，一些致病性真菌物种的定量的流式细胞仪的方法已经描述4-6。然而，由于参与共享流式细胞仪用生物安全2级（BSL2）或BSL3级病原体生物安全遏制问题，采用这项技术已经有限。像流式细胞仪，图像仪是一个敏感和快速的细胞定量分析的方法。然而，可以进行图像分析，在一小部分的成本，而比较的结果7 –11。在这里，我们描述了进行图像分析致病真菌与宿主细胞的方法。我们证明了我们的方法使用两个人类病原真菌： 组织胞浆菌和白色念珠菌。H.荚膜是一种二态真菌病原体引起呼吸系统疾病，它生长在人类作为芽殖酵母和肺泡巨噬细胞内复制。 白色念珠菌是人类共生的物种，偶尔会导致念珠菌。我们表明，图像仪可快速定量的可视化能力，加上这些酵母菌。
Protocol
Representative Results
Discussion
图像流式细胞仪允许用户捕捉到高质量的图像，并使用专门的软件，进行快速定量细胞。一个潜在的挑战，通过图像分析微生物的发病机制中的字段是一个混合的人口中存在的细胞，包括哺乳动物宿主细胞，微生物计数。在这里，我们表明，图像分析，可用于体外巨噬细胞的感染过程中的量化可行的致病性酵母菌。我们的方法不仅忠实地概括在体外巨噬细胞感染实验期间观察?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
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