ここでは、タイプIとタイプIIを使用するための方法を報告する<em>Δku80</emの>株<em>トキソプラズマ</em>効率的に機能的なゲノム解析のためのターゲット遺伝子欠失、遺伝子置換を生成する。
相同組換えを利用した標的遺伝子操作は、遺伝子機能と表現型(単数または複数)の詳細図を得るための機能的なゲノム解析のための選択方法である。標的遺伝子の欠失、標的突然変異、補完遺伝子の機能、および/またはタグ付けされた遺伝子を有する変異株の開発は、これらの遺伝子操作を効率的に二重によって媒介積分を用いて、目的の遺伝子座を標的とすることができる場合は特に、遺伝子機能に対処するための強力な戦略を提供する相同組換えを渡る。
非相同的組換えの非常に高いレートの変動により、 トキソプラズマ原虫のゲノム解析の機能は、以前は、特定の遺伝子座に遺伝子欠失、遺伝子の交換を標的とする効率的な方法が存在しないことによって制限されている。最近、我々はI型とII型Tの株で非相同組換えの主要な経路を廃止遺伝子encodinを削除してトキソプラズマG Ku80がタンパク質1,2。 Δku80株は、in vitroおよびin vivoでタキゾイト(急性)とブラディゾイト(慢性)段階で正常に動作し、実質的に相同組換えの100%の頻度を示す。 ΔKu80が株は単一の遺伝子で同様のゲノムスケール1-4で機能的なゲノム研究が実現可能に。
ここでは、T.でのアプローチを対象とした遺伝子を進めるためにタイプIとタイプIIΔku80Δhxgprt株を使用する方法を報告するトキソプラズマ 。私たちは、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HXGPRT)選択マーカーの標的挿入や欠失により遺伝子欠失、遺伝子の交換、およびタグの遺伝子を生成するための効率的な方法を概説する。プロトコルを対象の遺伝子は、寄生虫のゲノムの機能解析を進めるために、持ち運び単一菌株を開発するΔku80株では、様々な方法で使用することができる複数のターゲット遺伝子操作。この遺伝的方法とその後の表現型アッセイのアプリケーションがTの生物学の基本的かつユニークな側面を明らかにするトキソプラズマやマラリア( マラリアのsp。)とクリプトスポリジウム症( クリプトスポリジウム ) を引き起こす関連の重要なヒト病原体。
トキソプラズマは、しばしば一般的な偏性細胞内寄生原虫であり、慢性的に動物と人間5の広い範囲に感染します。これは病原体によって10億以上の人間が現在であることを推定して慢性的に感染している。 T.によって引き起こされる疾患の重要性に加えてトキソプラズマ感染症、実験的なツール、強力なゲノム資源6の可用性の向上は、in vitroでの成長と優れたマウスモデルでの容易T.を作ったトキソプラズマ細胞真核生物病原体や、マラリア( マラリアのsp。)とクリプトスポリジウム( クリプトスポリジウム )5,7として壊滅的な病気を引き起こす他の重要アピコンプレクサ原虫の広範な研究のための主要なモデルシステム。モデル生物としてのトキソプラズマの重要な制限は、遺伝子操作をターゲット運ぶ子孫の非効率的な回復となっています。これのproble遺伝子ターゲティングでmは、T.、野生型株における非相同的組換えの非常に高い周波数に対して相同組換えの低周波によるものである広範なDNA相同性が遺伝学的研究2で使用したDNA標的分子に設けられていても原虫 。
我々は最近、遺伝子組み換え型の非相同組換えの主要な経路をブロックKu80がタンパク質1,2をコードする遺伝子を削除して、IとII型トキソプラズマの株。 I型およびIIΔKu80が菌株はin vitroおよびin vivoでタキゾイトとブラディゾイトの段階でインビトロおよびインビボの両方の正常な成長率、大きさ及び挙動を示す結果の型が、これらの株は、相同組換えの本質的に100%の周波数を示し、この表現型は、いくつかのカントーに数百の標的に遺伝子操作の急速に分離希望の子孫の可能性が高くなりますusand倍1,2,4。最近のコミュニティ全体のIとII型ΔKu80が株がペースアップする大幅上昇持つ型の使用、様々ならびにT.におけるターゲット遺伝子アプローチの成功率トキソプラズマ1-4,8-13。ここでは、TのΔKu80が株で、標的遺伝子欠失、遺伝子置換、遺伝子タギングのための包括的なプロトコルを記述するトキソプラズマ 。我々はデザインと確実にトキソプラズマのΔKu80が株で特定の遺伝子または遺伝子座に遺伝子操作をターゲットにする方法を示します。
ここでは、対象となる遺伝子欠失、遺伝子の交換、および/ またはタグ付けされた遺伝子を持っている遺伝子操作子孫の効率的な回収を可能にするためにΔKu80が寄生虫株にターゲティング効率的な遺伝子のためのプロトコルを提供する。これらのメソッドの逐次実行は1-3単一または複数の標的遺伝子操作を含む寄生虫変異体を単離するための信頼性のあるアプローチを提供します。ターゲット削除の世代が複数の要因に依存しながら、提示戦略とプロトコルΔKu80が株の使用が大幅にTの正確に定義された変異株の作製効率と使いやすさを向上させ機能的ゲノム研究のためのトキソプラズマ 。
Tのゲノム無性段階でトキソプラズマは半数体である。したがって遺伝子を削除することを計画したときにするための考慮事項は、遺伝子がin vitroで不可欠であってはならないということです。それにもかかわらず、厳しく監督の効率Ku80が Δ株における影の遺伝子ノックアウトは非常に高く、これが著しく損なわ複製速度を有する変異株の単離を可能にする。標的遺伝子が不可欠である場合には、寄生虫はしばしば選択時に複製することをやめる。標的遺伝子操作で別の重要な要因は、ゲノム標的側面 の少なくとも620塩基対とその完璧な相同性は2検出ターゲット統合を得るために必要とされています。同性の長い地域約1,000塩基対の標的DNAの脇腹を標的とし、使用して、より高い効率を生み出す信頼性と効率的なアプローチ1-4です。このような理由からゲノムターゲティングフランクがT.の同じ株から生成されることが重要である遺伝的に操作されている株とトキソプラズマ (RH、プルデンシャル)。十分な相同性の欠如は、しばしば1ゲノム標的脇腹の目標と統合になりますが、他のことはできません。不完全な統合やノックアウトMAを取得するために失敗yはまたエピソーム永続に起因する。すぐにトランスフェクション後、標的分子のすべてがエピソームを非統合され、時には標的分子は、多くの世代のためにエピソームとして存続することができます。 KBP再サブクローニングする前に選択の下に寄生虫を渡すために継続〜1の標的DNAの両サイドを使用すると、頻繁にエピソーム永続に関連する問題を解決します。
ノックアウトが検証されるとHXGPRTマーカーが削除されると、遺伝子ターゲティング戦略は1-3単一の寄生虫株で複数の遺伝子欠失を生成する第二GOIに繰り返すことができます。欠失、置換、またはタグ遺伝子の発生は、異なる選択可能なマーカー( ブレオマイシン、CAT、ピリメタミン耐性DHFR等)を使用することによって達成することができる。 CAT選択可能なマーカーは、現在Ⅱ型ΔKu80がプルデンシャルゲノム1で存在しているが、このマーカーはHXGPRTを使用して除去することができます</em>を選択プロトコルは、ここで説明する。私たちの手で、HXGPRT選択が単一コピー対象と挿入がMPA + X培地。HXGPRTで堅牢な選択のための十分である最高ターゲティング効率が最も安全で効率的なマーカーでは、またのターゲット削除のため、現在有用なアプローチを提供しています6 -チオキサンチン(6TX)選択2,3を使用して選択可能なマーカー( 図3)。したがって、このプロトコルは、複数のターゲット遺伝子操作で定義された変異株を開発するための唯一の現在のアプローチを提供します。
このプロトコルは、 トキソプラズマのΔKu80が株で標的遺伝子操作のための貴重かつ効率的な方法を提供し、単一の遺伝子、遺伝子の家族、またはゲノムワイドな機能ゲノム研究の解析に適用することができる。 ΔKu80が株の可用性1,2に先立ち、これらのアプローチが原因伊根に広く現実的ではありませんでしたこれらのメソッドのfficiency。したがって、このプロトコルは、 トキソプラズマの標的遺伝子操作のために広く適用可能であり、寄生虫学、ホストの応答、および機能ゲノミクスに関する質問の範囲に対処するに興味を持ってすべての研究者にアクセス可能である。
The authors have nothing to disclose.
この作品はDJBにNIHから助成金(AI041930、AI073142、AI075931及びAI091461)によってサポートされていました。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Overlap Primers | Integrated DNA Technologies | 4 nmole Ultramer DNA oligos | |
Validation Primers | Integrated DNA Technologies | 100 nmole DNA Oligo | |
Yeast Strain #90845 | ATCC | Designation FY834 | |
Shuttle Vector pRS416 | ATCC | 87521 | |
DH10B E. coli | Invitrogen | 12033-015 | SOC broth in kit with E. coli |
Resuspension Buffer | Qiagen | Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit | |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
Glass Beads | Scientific Industries | SI-BG05 | 0.5 mm acid-washed |
Qiacube Automated Robotic Work Station | Qiagen | ||
Electroporation Cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | 2 mm-gap |
BTX600 electroporator | BTX | ||
Maxiprep Kit | Qiagen | 12662 | QIAprep Spin Maxiprep Kit |
25 cm2 Canted neck plug seal flask | Corning | 430168 | |
150 cm2 Canted Neck plug seal flask | Corning | 430823 | |
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | ATCC | SCRC1041 | |
Swin-lok Filter Holder | Whatman | 420200 | 25-mm-diameter |
Membrane | Whatman | 110612 | Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter |
Mycophenolic acid (MPA) | Sigma | ||
Xanthine (X) | Sigma | ||
96-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
24-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
MEM Eagle Media | Lonza Biowhittaker | 12-611F | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-111 | |
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) | Gibco | 15240-062 | |
Spin Column | Primm Labs | PAE-100 | Easy Clean DNA Extraction Spin Kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
6-thioxanthine | Acros Organics | ||
Tissue DNA Minikit | Qiagen | 51104 | QIAamp DNA Blood Mini Kit |
Cell Culture Freeze/Recovery Media | Gibco | 126-48-010 | |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30028.02 | minus calcium, minus magensium |