在这里,我们报道了一种采用I型和II型<em>Δku80</em菌株<em>弓形虫</em>高效的生成有针对性的基因缺失和基因替换为功能基因组学分析。
针对性的遗传操作使用同源重组的方法的选择功能基因组学分析,以获得基因的功能和表型(次)的详细视图。与靶基因缺失,有针对性的突变,传统的基因的功能,和/或标签的基因的突变株的发展提供了强有力的战略,以处理基因的功能,尤其是当这些基因操作可以有效地针对感兴趣的使用整合介导的基因位点,通过双击跨越同源重组。
由于非同源重组,功能基因组学分析弓形虫率非常高的情况下有效的方法,针对特定基因位点的基因缺失和基因替换先前已限制。最近,我们取消了非同源重组的主要途径,在I型和II型菌株T.弓形虫删除基因encodin克的KU80蛋白质1,2。 Δku80株正常工作过程中速殖子(急性)和bradyzoite(慢性) 在体外和体内的阶段,并表现出基本上是一个100%的同源重组频率。 ΔKu80的菌株进行功能基因组学研究可行的单一基因,以及基因组规模1-4。
在这里,我们报告的方法使用类型I型和IIΔku80Δhxgprt株推进T中的基因打靶方法弓形虫 。我们概述了用于产生对象的次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)可选择标记的插入或缺失的基因缺失,基因置换和标记基因的有效方法。所描述的基因打靶协议可以用在多种方式推进Δku80株寄生虫基因组功能分析和开发单一菌株进行多个有针对性的遗传操作。这种遗传方法的应用和随后的表型分析将揭示T.生物学方面的基础和独特的弓形虫和相关重大人类病原体引起的疟疾( 恶性 )。和隐孢子虫病( 隐孢子虫 )。
弓形虫病是一种常见的专性细胞内原生动物寄生虫,经常和慢性感染动物和人类的广泛的5。据估计,目前超过1亿人是慢性感染这种病菌。除了T所引起的疾病的重要性弓形虫感染的实验工具,强大的基因组学资源,提高可用性,易用性在体外生长和优良的小鼠模型T.弓形虫广泛的研究真核细胞病原体和其他重大apicomplexan寄生虫引起严重的疾病,如疟疾( 恶性 )。和隐孢子虫( 隐孢子虫 )5,7领先的模型系统。 à重大限制弓形虫作为模式生物的后代进行有针对性的遗传操作一直是低效恢复。这的proble基因打靶米是由于同源重组频率低,相对于非同源重组的频率非常高,在野生型菌株T.广泛的DNA同源性弓形虫即使目标DNA分子遗传学研究2。
最近,我们的基因类型的非同源重组的主要途径受阻I型和II株弓形虫通过删除编码的KU80蛋白质1,2基因。由此产生的类型I和II型ΔKu80的菌株表现出正常的生长速率, 在体外和在体内过程中速殖子和bradyzoite阶段的体外和体内的大小和行为,但是,这些菌株表现出基本上是100%的同源重组频率,这表型的可能性增加迅速隔离所需的后代有针对性的遗传操作由几百到几寿美国和倍1,2,4。最近社会广泛使用的类型,I型和IIΔKu80的菌株有显着提升的步伐,品种,以及T中有针对性的遗传方法的成功率弓形虫1-4,8-13。在这里,我们描述了一个全面的协议,有针对性的基因缺失,基因置换,基因标记ΔKU80株T.弓形虫 。我们演示了如何设计和可靠的目标遗传操作特定的基因或基因位点在ΔKU80株弓形虫。
在这里,我们提供了一个协议,用于有效的基因定位在ΔKu80的寄生虫株基因操纵拥有对象的基因缺失,基因置换和/或标签的基因的后代,以使有效地回收。的顺序执行这些方法提供了可靠的包含单个或多个目标的遗传操作1-3的寄生虫突变体的分离方法。有针对性的删除而产生取决于多种因素,ΔKu80的应变与所提出的策略和协议的使用极大地提高了工作效率和易于精确定义的突变株T.功能基因组研究中的弓形虫 。
基因组的T。弓形虫在无性阶段的单倍体。因此,考虑规划时删除基因,该基因不得在体外至关重要的。然而,效率的圆盾鼎基因敲除在ΔKU80株是非常高,这使隔离显著受损的复制率的突变株。如果有针对性的基因是必不可少的,寄生虫往往在选择过程中停止复制。针对性的基因操纵的另一个关键因素是必须取得至少620 bp的基因组靶向侧翼检测到有针对性的集成,完美的同源性。较长的同源性区域产生更高的效率目标和使用目标约1,000 bp的DNA侧翼是一个可靠和有效的方法1-4。出于这个原因,重要的是产生T的同一菌株的基因组的目标侧翼刚地弓形虫 (RH,保诚)作为操纵基因的菌株。缺乏足够的同源性,经常导致在1个基因组的定位后刀面的靶向整合,但没有其他。不完全整合或未能取得淘汰赛MAŸ也可以由于游离持久。转染后,立即所有的靶向分子的非集成的附加体,有时靶向分子,可以持续许多世代的附加体。 〜1 KBP使用目标DNA侧翼,并继续通过寄生虫在选择之前,再亚克隆经常解决与游离的持久性有关的问题。
一旦淘汰赛进行验证,并除去的HXGPRT标记,基因打靶策略可以重复1-3在一个单一的寄生虫株产生多个基因缺失的第二GOI。缺失,替换,或标记基因的产生,也可以通过使用不同的可选择的标记物( 博莱霉素,CAT,乙胺嘧啶抗性DHFR等)。 CAT可选择标记虽然目前存在于不同IIΔKu80的保诚基因组1,此标记可以使用HXGPRT除去</>选择这里描述的协议。在我们的手中,HXGPRT选择是最安全和最有效的靶向效率最高的单拷贝针对性插入标记是足够强大的选择在MPA + X介质。HXGPRT还提供了目前唯一有用的方法,有针对性地删除一个可选择的标记( 图3)使用6 -硫代黄嘌呤(6TX)选择2,3。因此,该协议提供了目前唯一的方法定义的突变株与一些有针对性的遗传操作。
ΔKu80的弓形虫株进行有针对性的遗传操作,该协议提供了一个有价值的和有效的方法,和适用于一个单一的基因,基因家族,或功能基因组的全基因组研究的分析。 ΔKu80的菌株1,2之前,可用的,这些方法尚未得到广泛应用,由于到该INE这些方法fficiency。因此,该协议是广泛适用于有针对性的遗传操作弓形虫和所有感兴趣在寄生虫宿主反应,生物学,功能基因组学的问题上解决一系列调查访问。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到补助从NIH DJB(AI041930,AI073142,AI075931,AI091461)。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Overlap Primers | Integrated DNA Technologies | 4 nmole Ultramer DNA oligos | |
Validation Primers | Integrated DNA Technologies | 100 nmole DNA Oligo | |
Yeast Strain #90845 | ATCC | Designation FY834 | |
Shuttle Vector pRS416 | ATCC | 87521 | |
DH10B E. coli | Invitrogen | 12033-015 | SOC broth in kit with E. coli |
Resuspension Buffer | Qiagen | Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit | |
Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | QIAprep Spin Miniprep Kit |
Glass Beads | Scientific Industries | SI-BG05 | 0.5 mm acid-washed |
Qiacube Automated Robotic Work Station | Qiagen | ||
Electroporation Cuvette | USA Scientific | 9104-5050 | 2 mm-gap |
BTX600 electroporator | BTX | ||
Maxiprep Kit | Qiagen | 12662 | QIAprep Spin Maxiprep Kit |
25 cm2 Canted neck plug seal flask | Corning | 430168 | |
150 cm2 Canted Neck plug seal flask | Corning | 430823 | |
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | ATCC | SCRC1041 | |
Swin-lok Filter Holder | Whatman | 420200 | 25-mm-diameter |
Membrane | Whatman | 110612 | Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter |
Mycophenolic acid (MPA) | Sigma | ||
Xanthine (X) | Sigma | ||
96-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
24-well Tissue Culture Tray | Corning Costar | ||
MEM Eagle Media | Lonza Biowhittaker | 12-611F | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-111 | |
Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti) | Gibco | 15240-062 | |
Spin Column | Primm Labs | PAE-100 | Easy Clean DNA Extraction Spin Kit |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | ||
6-thioxanthine | Acros Organics | ||
Tissue DNA Minikit | Qiagen | 51104 | QIAamp DNA Blood Mini Kit |
Cell Culture Freeze/Recovery Media | Gibco | 126-48-010 | |
Phosphate Buffered Saline | Hyclone | SH30028.02 | minus calcium, minus magensium |