Wir beschreiben die Herstellung von drei Prüfmustern und wie sie verwendet werden, um beurteilen zu optimieren und die Leistung der STORM-Mikroskope. Mit diesen Beispielen zeigen wir, wie Roh-Daten zu erfassen und verarbeiten sie zu Super-Resolution-Bilder in Zellen von ca. 30-50 nm Auflösung zu erwerben.
STORM ist eine neu entwickelte Super-Resolution-Mikroskopie-Technik mit bis zu 10-mal höhere Auflösung als Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Jedoch, wie das Bild in eine ganz andere Weise als normal erworben, durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül, gibt es einige bedeutende Herausforderungen für die Nutzer in die versuchen, ihre Bildaufnahme zu optimieren. Um diesen Prozess zu unterstützen und gewinnen mehr Einblick, wie STORM arbeitet präsentieren wir die Herstellung von 3 Testproben und die Methodik der Erfassung und Verarbeitung von STORM Super-Resolution-Bilder mit typischen Auflösungen von 30-50 nm auf. Durch die Kombination der Testproben mit der Verwendung der frei verfügbaren Rainstorm Verarbeitungssoftware ist es möglich, eine große Menge an Informationen über Bildqualität und Auflösung zu erhalten. Mit Hilfe dieser Messdaten ist es dann möglich, die Bildgebungsverfahren von der Optik zu optimieren, die Vorbereitung, Farbstoff Wahl, Pufferbedingungen, und Bildaufnahme-Einstellungen probieren. Wir sind einelso zeigen Beispiele für einige häufige Probleme, die zu einer schlechten Bildqualität führen, wie laterale Drift, wo die Probe bewegt sich während der Bildaufnahme und Dichte bezogene Probleme, die in der "Fehllokalisation" Phänomen.
Vor kurzem wurde ein Bereich der optischen Mikroskopie Techniken entwickelt worden, die typischerweise als Super-Resolution-Mikroskopie oder Nanoskopie, die die Beugungsgrenze zu umgehen und erzeugen Bilder mit einer Auflösung von 100 nm oder besser 1,2 können bezeichnet. Seit der Ankündigung von Super-Resolution-Mikroskopie als die Nature Methods Verfahren des Jahres 2008 gab es eine große Entwicklung von Lokalisierungs-basierten Mikroskopen. Zum Beispiel gibt es Mehrfarbanwendungen 3-6, 7-12 3D-Implementierungen und Anwendungen auch mit lebenden Zellen 5,13-17. Darüber hinaus, da diese Systeme werden in die Hände von Zellbiologen kommerzialisiert und werden nun ihren Weg aus der Optik Laboratorien gibt es wahrscheinlich eine weitere Erhöhung ihrer Verwendung und Anwendung der biomedizinischen Fragen.
Ein Zweig dieser Familie ist die Lokalisierungsbasierte Methoden, die durch den Aufbau eines Bildes Molekül-für-Molekül zu arbeiten. Ichn Um dies zu tun, muss der Großteil der Fluoreszenzmoleküle in der Probe aus, so dass nur wenige räumlich getrennten Moleküle zu einem Zeitpunkt aktiv geschaltet sein. Diese Moleküle werden dann schnell ein-und ausgeschaltet, und viele Bilder aufgenommen werden, so dass ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung ist abgebildet, um die darunterliegende Struktur mit Unter-Beugungs Präzision wiedergeben. Eine Reihe von Ansätzen veröffentlicht einschließlich GSDIM 18, 19 PALM, FPALM 20, 21 und STORM RESOLFT 22. Algorithmen, die die Position eines Einzelmoleküldetektion messen kann dann verwendet werden, um die tatsächliche Position des Moleküls mit Genauigkeiten besser als 20 nm unter Verwendung von Gauß-Fitting 23 zu lokalisieren, beispielsweise rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26, 12 und palm3d Regensturm 27. Bei der Abbildung Zelle oder anderen biologischen Proben, die eine hohe Moleküldichte haben, ist es daher erforderlich, viele Tausende von Rahmen zu nehmendiese blinkt, räumlich getrennten, Signals, um Bild ein erheblicher Anteil der markierten Moleküle.
Stochastische optischen Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) und der eng verwandten dSTORM und GSDIM Methoden-basierte Lokalisierungs Super-Resolution-Methoden, die gezeigt wurde, dass mit handelsüblichen organischen Farbstoffen 21 zu arbeiten. Sie haben sich seit gezeigt wurde für eine Reihe von verschiedenen Farbstoffen 28-30, die die Methodik insbesondere wegen der Spezifität und der relativen Bequemlichkeit der etablierten Immunmarkierung Ansätze zur Fluoreszenzmikroskopie durch attraktiv zu sein. Folglich gibt es einen einfachen Zugang zu einer Reihe von Farbstoff-Antikörper-und Farbstoff-Biomolekül-Konjugate, die das Potenzial in der Lokalisierung Basis-Superauflösende Bildgebung verwendet werden müssen. Während die allgemeinen Grundsätze des STORM und ähnliche Ansätze sind relativ einfach, und auf den ersten Blick die Hardware und die Probenvorbereitung scheinen relativ straightforward, gibt es eine Reihe von Schritten in dem Prozess, der entscheidend für die Erreichung hoher Qualität, artefaktfrei, Super-Resolution-Bilder sind.
Wie bei allen Mikroskopie-Techniken kann der Prozess des in 3 Hauptschritte betrachtet werden: erstens, Probenvorbereitung, zweite Bildaufnahme und, drittens, die Bildverarbeitung und / oder Bildanalyse und Interpretation. Die zusätzliche Auflösungsvermögen und Verfahren zur Erzeugung von Super-Resolution-Bildern mit einem Lokalisierungs-Ansatz führt einige neue Probleme und Überlegungen 31-33. Beginnend mit der Probenvorbereitung bei der Durchführung der Immunmarkierung, insbesondere indirekte Immunfluoreszenz, wo eine primäre und sekundäre Antikörperkombination verwendet wird, ist anzumerken, dass der fluoreszierende Farbstoff kann bis zu 20 nm von dem Molekül von Interesse sein werden. Im Fall von Mikrotubuli, führt dies zu Durchmessern von 35-50 nm im Vergleich mit einer erwarteten Mikrotubuli-Durchmesser von 25 nm 28,30. Auch sollte die Markierungsdichte meet die Nyquist-Kriterien, um eine hohe Bildqualität 14 zu erzeugen. Zum Beispiel für eine erwartete Bildauflösung von 20 nm entlang einer filamentösen Struktur sollte ein Farbstoffmolekül mindestens alle 10 nm 27 sein. Während viele Farbstoffe sind veröffentlicht worden, um für die Lokalisierung Basis nähert sich die Gesamtleistung des Farbstoffs ist eine Mischung aus mindestens vier wichtige Kriterien, nämlich detektierten Photonen pro Schaltereignis (die Helligkeit jedes Blinzeln – heller ist besser) arbeiten, das Gleichgewicht auf -off-Arbeitszyklus (das Kontrastverhältnis von Farbstoffen in der Aus-Zustand gegenüber – mehr ist im Allgemeinen besser ab), die Überlebensfraktion (eine geringe Bleichrate ist besser) und die Anzahl der Schaltzyklen (die Anzahl der Blinkzeichen pro Fluorophor – mehr ist besser für hohe Auflösung, obwohl ein Aufblinken pro Fluorophor kann ein Vorteil für die Molekül-Zwecke Zählen sein). Die Situation wird weiter durch die Tatsache, dass diese Eigenschaften für einen bestimmten Farbstoff kann in verschiedenen Pufferbedingungen variieren und kompliziertLaserleistung mit 28,29. Zudem sowie diese einzigartige STORM Erwägungen kann die Bildqualität durch die Optimierung der Probenvorbereitung in der gleichen Weise wie traditionelle Fluoreszenzmikroskopie-Techniken beispielsweise durch Minimierung von Eigenfluoreszenz durch Modifikation Fixierungsbedingungen und die Verwendung von Reagenzien Abschrecken verbessert werden. Auch ist die Minimierung nicht-spezifisch gebundenen Fluorophore wichtig, welche durch Einstellen Etikett Konzentrationen, Inkubationszeiten und Blockieren und Waschschritte durchgeführt werden können.
Der zweite Schritt der Bildaufnahme ist ebenfalls kritisch. Die optimalen Einstellungen des Mikroskops wird auf die Farbstoff, Pufferbedingungen Markierungsdichte und Probentyp, z. B. Monoschichten auf Glas, Zellen oder Gewebeproben ab. Die wichtigsten Überlegungen sind Kamera Belichtungszeit, Bildnummer, Beleuchtungswinkel (TIRF, Hilo, Epi) und Laserleistung. Das Ziel ist, so viele helle räumlich getrennten blinkt so schnell wie möglich zu sammeln. Wenn der Hintergrund is sehr hoch ist oder die blinkt nicht sehr hell, mit anderen Worten, das Signal-zu-Rauschverhältnis schlecht ist, wobei der Rekonstruktionsalgorithmus nicht in der Lage, die Positionen so genau zu lokalisieren. Sowie die Maximierung der Lokalisierungsgenauigkeit, also die Genauigkeit, mit jedem Molekül Position gemessen werden kann, hängt die Bildqualität auch bei einer hohen Anzahl von Lokalisierungen. Wenn eine unzureichende Anzahl der Moleküle von Interesse sind abgebildet, entweder aufgrund der schlechten Markierungseffizienz, übermäßiges Ausbleichen oder eine unzureichende Bildnummer, dann das resultierende Bild Super-Resolution wird punktiert und diskontinuierlich sein als Nyquist-Kriterien nicht eingehalten, 14,27 .
Und schließlich ist der dritte Schritt, Bildverarbeitung, besonders wichtig im Vergleich mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken. Es gibt eine Reihe von frei im Handel erhältlich und Algorithmen, die sowohl ein Vorteil, in Bezug auf Auswahl, und ein Nachteil ist, dass es verwirrend sein kann zu wissen, welche am besten geeignet ist, um zu verwenden. Wenn zum Beispiel die Rohdaten gut verteilte räumlich getrennte blinkt dann eine Einzelmolekül-Anpassungsalgorithmus sehr genau und effizient zu sein, beispielsweise durch die spärlich Anpassungsalgorithmen im Regensturm 27, rapidSTORM 24,25, palm3d 12 und 26 QuickPALM Software . Wenn die Rohdaten enthält eine Menge von überlappenden Signalen dann Algorithmen, die besser geeignet sein können, umfassen DAOSTORM 34, 35 und 3B deconSTORM 36. Darüber hinaus sind diese Algorithmen enthalten Schwellenwerte für verschiedene Kriterien wie Signal zählt, oder Photonen pro Blinken, sowie verschiedene Bilddarstellungsmöglichkeiten wie die Visualisierung mit geglätteter Gauß-Funktionen oder als Histogramme mit Pixelraster, wo der Super-Auflösungspixelgröße kann durch den Benutzer ausgewählt. Alle diese Optionen ändern das Aussehen des fertigen Bildes und haben Auswirkungen auf die Bildinterpretation und-analyse.
<p class="jove_content"> Daher präsentieren wir 3 Testproben, die den neuen Benutzer mit einem Ausgangspunkt für Dye-Lokalisierung Basis Super-Resolution-Experimente, die aus Gründen der Klarheit werden wir so STORM zu beziehen und erfahrene Anwender die Möglichkeit bieten wird, um weiter zu optimieren, ihre Experimente. Erstens ist es möglich, die Oberfläche des Glases mit einer fluoreszierenden Schicht von Dextran-Farbstoff-Konjugat. Dies bietet eine schnelle und einfache Möglichkeit, um festzustellen, dass das Mikroskop-, Farbstoff-und Puffer arbeiten daran, blinkt Fluoreszenzsignal erzeugen. Das Verfahren kann dann durch den Vergleich mittlere Lokalisierungsgenauigkeit und Anzahl von Regensturm Metriken erzeugt werden, um Pufferbedingungen zu optimieren, Bildaufnahme-Einstellungen und testen verschiedene Farbstoffe erweitert werden. Zweitens stellen wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von Aktin-Filamenten auf Glas, das leicht mit Phalloidin-Farbstoff-Konjugaten markiert werden können. Diese bieten ideale Strukturen, um Messungen der Auflösung in der Regel 27 und der Halbwertsbreite (FWHM) nehmender ein Faden wird als eine empirische Abschätzung der Resolution 37 gegeben. Es ist zu beachten, dass die Auflösung variiert zwischen den Proben und zwischen den Bildern innerhalb der gleichen Probe, weil Auflösung in der Lokalisierung Basis Super-Resolution-Mikroskopie ist eine Funktion der Fluorophor Helligkeit, Hintergrundgeräusche und Lokalisierung Dichte 27 und das sind nicht unbedingt konstant über der Probe werden. Aktin-Filamente werden verwendet, um mögliche Artefakte wie mislocalizations demonstrieren und treiben und wie sie mit Software-Funktionen innerhalb von Rainstorm identifiziert werden. Außerdem beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Bezugsmarkierungen sowohl richtige Maß und Drift. Und drittens die Färbung der Zellen mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)-Farbstoff-Konjugate beschrieben. EGF ein nützlicher Indikator für die superauflösenden Bildern, weil ein Teil des Rezeptors auf der Zelloberfläche eine Endocytose durchläuft über Vesikel, die Unter-Beugungsstrukturen Größe von etwa 50-150 nm Durchmesser 27,38,39.Wir zeigen, mit einigen einfachen Testproben und der frei verfügbaren Software-Verarbeitung Rainstorm ist es möglich, STORM Super-Resolution Imaging optimieren. Diese Werkzeuge und Methoden wird nützliche Startpunkte für neue Benutzer und Möglichkeiten für erfahrene Benutzer das Vertrauen in ihre Mikroskope und ihre Verwendung von ihnen für die biologische und zelluläre Strukturen mit bisher unerreichter Genauigkeit untersuchen zu erhöhen. Durch Verwendung einer Kombination von Proben mit bekannter oder gut verstanden Strukturen und einem Algorithmus, der eine Anzahl von nützlichen Bildqualitätsmetriken, wie Mittelwert Präzisionsschätzungen Lokalisierungsnummer und Histogramme, ist es möglich, die Bildqualität zu verbessern und mehr Vertrauen haben, erzeugen kann, in der bildgebenden Verfahren STORM. Es gibt keine one-size fits all Ansatz zur Erfassung der Daten, da es eine Reihe von verschiedenen kommerziellen und selbst gebauten Mikroskop-Konfigurationen, die verwendet werden können. Darüber hinaus gibt es viele Probenvorbereitung und Bildaufnahmeschritte, die beeinflussen könnenReferenz das endgültige Bild daher mit Software-Tools und Testmuster ist entscheidend für das Verständnis und die Optimierung STORM Bildqualität.
Darüber hinaus können diese Protokolle nützliche und weniger zweideutig Möglichkeiten der Fehlerbehebung von Problemen, die auftreten können. Beispielsweise das Dextran Probe ist ein sehr nützlicher Weg, um zu ermitteln, ob es eine Fehljustierungen oder ungleichmäßige Beleuchtung der Probe. Wenn es Bedenken, dass die Schaltpuffer kann nicht arbeiten eine sehr einfache Sichtprüfung, um zu sehen, ob es eine "blinkende 'wird Ihnen helfen. Aktinfilamente sind eine nützliche Methode zur Messung der Auflösung mit FWHM Vergleiche sowie Hervorhebung Drift und Fehllokalisation Artefakte. Es sollte jedoch angemerkt, daß als Lokalisierung basierte Superauflösungsverfahren können Fluorophor Dichte empfindlich sein, ungeachtet der anderen Faktoren, wie Belichtungszeit, Bildrate, Laserleistung und der Art und Weise wird das Bild verarbeitet werden, ist es unmöglich, zuweisen Der Beschluss, eineninsbesondere Mikroskop und davon ausgehen, dass alle Bilder wird diese Auflösung haben. Was ist möglich, jedoch ist es, verschiedene Aspekte der Auflösung wie Mittelwert Lokalisierungsgenauigkeiten, Lokalisierung Zahl messen und Drift-27. Auch wenn Bezugsmarkierungen können nicht in jedem Versuch sie können eingearbeitet werden, zumindest, verwendet, um ein Mikroskop-System, seine Umwelt besser zu verstehen, zu charakterisieren und operativen Überlegungen wie, wie viel Zeit erforderlich ist, um das thermische Gleichgewicht erreicht nach dem Start werden. Sowie Korrektur von lateralen Drift können Bezugsmarkierungen verwendet werden, zu charakterisieren und zu korrigieren Axialdrift, obwohl dies erfordert die Verwendung einer astigmatischen Linse und einen Rückkopplungsmechanismus, um die Probenposition zu korrigieren, während die Bilder erworben 43. Handels Super-Resolution-Systeme gehören in der Regel eine Art von Stabilitätskontrolle oder Fokus-Lock-Mechanismus, der eine praktische Lösung für die Korrektur Fokusdrift sein können.
Es gibt eineWieder Alternativen zu unspezifisch Beschichten des Glases mit Dextran, wie die Verwendung von Farbstoffen, die direkt oder anderen konjugierten Moleküle, wie Sekundärantikörper. Eine Einschränkung dieser Ansätze ist, dass die Anzahl der Moleküle an der Glas gebunden ist nicht bekannt. Alternative filamentöse Strukturen, die verwendet wurden, schließen Mikrotubuli 28 und 21 DNA. Die Kombination von sehr geringer Größe und bequem im Handel erhältlichen Reagenzien machen jedoch Aktin eine attraktive Alternative, insbesondere der Abstand des divergierenden oder verzweigte Filamente können auch eine nützliche Messung der Systemleistung 27 sein.
Es gibt Raum für die weitere Entwicklung von Testproben, trotz der jüngsten Fortschritte in diesem Bereich 28,29,46,47. Insbesondere stellt Multi-Color-Imaging eine Reihe von Herausforderungen in allen drei Hauptaspekte der Bildgebung, Probenkennzeichnung, Bildaufnahme (Hardware) und Software (Bildverarbeitung und Ausrichtung). Es gibt ein seiteine Reihe von Publikationen die Lösung dieser Fragen 4-6 und es ist daher klar, dass geeignete Testproben und Methoden kritisch zu erzeugen und zuverlässig Interpretation dieser Bildtypen. In der Tat, vor kurzem wurde gezeigt, dass dSTORM könnte verwendet werden, um zwei Farbbilder zu nehmen, und zu beheben, die hochsymmetrische Natur der Kernporenkomplex und die Autoren vermuten, dass dies eine ideale Möglichkeit, um die Leistung der chromatischen Aberration 45 Korrekturen zu beurteilen. Ein weiterer interessanter Ansatz ist die Verwendung von DNA-Origami, ein nanoruler, die die Möglichkeit der Positionierung Fluorophore zu bestimmten Unter-Beugungs Abständen 46 schafft erstellen. Dies bietet eine Möglichkeit zur Beurteilung Auflösung und macht Abstandsmessungen. Jedoch ist das letztendliche Ziel, diese Superauflösungstechniken, um nicht-idealisierten Proben, wie Zellen, die komplexe dreidimensionale Strukturen anzuwenden. In diesem Fall wird eine Kombination aus gründlicheres Verständnis ter Technik kombiniert mit Software-Tools, die den Anwender bei der Erfassung von Daten, die Verarbeitung in geeigneter Weise, und Bereitstellung von Bild Metriken helfen, ist wahrscheinlich die letzte Antwort sein. 28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
Wir erkennen an, Mittel aus dem chemischen und biologischen Messtechnik-Programm von National Measurement Büro in Großbritannien. Wir danken Sebastian van de Linde, Miklos Erdelyi und Eric Rees für technische Beratung und Anregungen. Wir danken Miklos Erdelyi, Eric und Max Rees Ryadnov für hilfreiche Kommentare und Diskussionen zu diesem Manuskript.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |