我们描述了制备3个试样,以及如何可以被用来优化和评估STORM显微镜的性能。使用这些例子中,我们展示了如何获取原始数据,然后进行处理,以获得超分辨率图像约30-50 nm分辨率的细胞。
暴风影音是比标准的荧光显微镜技术更好的分辨率高达10倍最近开发的超分辨率显微镜技术。然而,由于图像被获取以非常不同的方式比正常的,通过建立一个图像分子通过分子中,有在试图优化其图像采集的用户一些显著挑战。为了帮助这一进程,并获得更多的深入了解,暴风影音的工作,我们提出了3编制试验样品和采集和处理风暴30-50纳米之间的典型分辨率超分辨率图像的方法。通过将试验样品与使用免费提供的暴雨处理软件也能够获得大量的关于图像质量和分辨率的信息。使用这些度量它然后就可以从光学优化成像过程中,样品制备,染料的选择,缓冲液条件,以及图像获取设置。我们一那会导致图像质量差一些共同的问题,如横向漂移,其中图像获取和密度在样品移动有关,导致了“错误定位”现象的问题LSO显示的例子。
最近已经开发出了一系列光学显微技术,通常被称为超高分辨率显微镜或纳米显微,这可绕过衍射极限,并具有100nm或更1,2分辨率生成图像。由于超分辨率显微镜公布,因为这是一年中自然 – 方法学方法在2008年,出现了大量的本土化为基础的显微镜发展。例如,有多种颜色的应用程序3-6,3D实现7-12,甚至活细胞的应用5,13-17。此外,由于这些系统都被商业化,现在使他们的出路光学实验室进入细胞生物学家手中有可能是生物医学问题进一步增加他们的使用和应用。
该家族中的一个分支是通过建立一个图像分子通过分子工作的定位为基础的方法。我n阶做到这一点,大部分样品中的荧光分子必须被关闭,因此,只有少数的空间上分离的分子是活性在任何一个时间。这些分子然后被迅速接通和断开与许多图像的拍摄,使人口的显著部分成象,以反映下层结构与子衍射精度。许多方法已经公布,包括GSDIM 18,PALM 19,FPALM 20,STORM 21和RESOLFT 22。用于测量一个单分子检测的位置的算法可以被用于定位该分子的实际位置与精度比使用高斯拟合23 20毫微米较好,例如rapidSTORM 24,25 QuickPALM 26 palm3d 12和暴雨27。当成像细胞或其它生物样品,其具有高的分子密度,因此,有必要采取几千帧的这个闪烁,在空间上分离,信号以图像的标记的分子的显著比例。
随机光学重构显微术(STORM)和高度相关dSTORM和GSDIM方法是定位为基础的超分辨率的方法,这已被证明与市售的有机染料21的工作。此后,他们被证明是适用于许多不同的染料28-30,这使得由于特异性和完善的免疫标记的方法来进行荧光显微镜相对方便的方法特别有吸引力。因此,人们很容易获得各种染料抗体和染料生物分子结合物,它在本地化为基础的超分辨率成像中使用的潜力。虽然暴风影音和类似方法的一般原理也比较简单,和一见钟情的硬件和样品制备看起来比较STRAightforward,有许多的过程步骤,这是实现高品质,无瑕疵的,超分辨率图像的关键。
如同所有的显微镜技术的方法可以在3个主要步骤被认为是:首先,样品制备,第二,图像采集和第三,图像处理和/或图像分析和解释。额外的解析力和产生超分辨率图像使用本地化为基础的方法的方法,引入了一些新的问题和注意事项31-33。与样品制备开始,进行免疫标记,尤其是间接免疫荧光法,其中初级和次级抗体组合使用时,应该指出的是,荧光染料可高达20nm的远离感兴趣的分子。在微管的情况下,这将导致在直径为35-50纳米,具有25纳米28,30的预期的微管的直径相比较。此外,该标记密度应该米EET奈奎斯特准则,以便产生高质量的图象14。例如为20纳米沿丝状结构的预期的图像分辨率应该有一个染料分子至少每10纳米27。虽然许多染料已发表的工作进行本地化的基于接近染料的整体性能是至少四个重要的准则,每个开关事件,即检测到的光子(各眨眼的亮度 – 亮越好)的混合,对平衡 – 断电占空比(染料在关闭与打开状态的对比度 – 更多关一般是越多越好),存活分数(低白化率越好)和开关周期数(每荧光闪烁的数字 – 更多对于高解析度好,虽然每荧光闪烁1次可以为分子计算目的的优势)。这种情况是由一个事实,即这些属性对于任何给定的染料可以以不同的缓冲条件而变化,并进一步复杂与激光功率28,29。此外,还有这些独特STORM考虑,图像质量可以通过在通过最小化由自发荧光修饰的固定条件和使用的猝灭试剂相同的方式更为传统的荧光显微镜技术,例如优化的样品制备改善。此外,最小化非特异性结合的荧光基团是很重要的,这可以通过调整标签的浓度,孵育时间和阻断和洗涤步骤来完成。
图像采集的第二个步骤也很关键。在显微镜上的最佳设置将取决于染料,缓冲液条件,标签密度和样品类型, 例如单分子膜在玻璃上,将细胞或组织样品。主要的考虑因素是相机的曝光时间,帧号,照射角度(TIRF,希洛,EPI)和激光功率。其目的是尽可能快地收集尽可能多的明亮空间上分离闪烁。如果我的背景的甚高或闪烁不很明亮,换句话说,信号与噪声的比率差,重建算法将无法向的位置作为精确定位。以及最大限度地提高定位的精度, 即与每个分子位置的准确性可以被测量,图像质量也依赖于大量的本地化的。如果感兴趣的分子的数量不足进行成像,无论是由于不良的标记效率,过度漂白或不足的帧数,然后将所得的超分辨率图像将点状和不连续的奈奎斯特准则将不会得到满足14,27 。
最后,用标准荧光显微技术相比,在第三步骤中,图像处理,就显得尤为重要。有一个广泛的自由和市售的算法,这既是优点,在选择方面,也是缺点,因为它可以混淆知道瓦特HICH是最适合使用。例如,如果原始数据有良好的间距空间上不同的闪烁然后单分子拟合算法可以非常准确,高效,例如通过在暴雨27可疏拟合算法,rapidSTORM 24,25,palm3d 12和QuickPALM 26软件。如果原始数据中含有大量的重叠信号,然后其可以是更合适的算法包括DAOSTORM 34 3B 35和deconSTORM 36。此外,这些算法包含的阈值不同的标准,如信号计数,或者每闪烁光子,以及各种不同的图像显示选项,例如具有平滑的高斯函数的可视化或作为直方图与像素网格,其中所述超分辨率像素大小可以是由用户选择。所有这些选项更改最终图像的外观和对图像判读和分析的影响。
<p class="jove_content">因此,我们提出了3个试验样品,将提供新的用户提供了一个起点,基于染料的定位为基础的超分辨率的实验,其中,为了清楚起见,我们将称之为STORM,有经验的用户有机会进一步优化他们的实验。首先,有可能以涂覆玻璃带的葡聚糖 – 染料结合物的荧光层的表面上。这提供了一个快速和简单的方法来建立的显微镜,染料和缓冲正努力产生闪烁的荧光信号。该方法可以再通过比较由暴雨产生的平均定位精度和数量指标来优化缓冲条件下,图像采集的设置和测试不同的染料进行扩展。其次,我们提出了一个简单的协议,用于在玻璃上,可以使用毒伞素染料结合物很容易准备标记肌动蛋白丝。这些提供了理想的结构,采取分辨率27和通常的半峰全宽(FWHM)的测量的灯丝是作为第37的经验估计。但应注意的是,分辨率样品之间和同一样品内的图像之间变化,因为在定位基于超分辨率显微镜的分辨率是荧光的亮度,背景噪声和本地化密度27的功能,并且这些不一定恒定整个样品。肌动蛋白丝,是要证明潜在的文物,如mislocalizations和漂移,以及他们如何可以在暴雨的软件功能来识别。此外,我们描述了使用的荧光基准标记到两个测量和正确的漂移。第三,细胞与表皮生长因子(EGF) – 染料偶联物的染色进行说明。 EGF提供的超分辨率图像的性能的有效指标,因为该受体在细胞表面的比例通过囊泡,它们是约50〜150 n个子衍射尺寸的结构经历胞吞作用米直径27,38,39。我们显示了一些简单的测试样品和可自由可用的处理软件暴雨能够优化STORM超分辨率成像。这些工具和方法将提供有用的起点为新用户和途径有经验的用户,以增加信心,他们的显微镜及其使用它们来研究生物学和细胞结构以前所未有的细节。通过使用具有已知的或容易理解的结构和算法,可以产生许多有用的图像质量度量,例如平均的估计精度,定位数和直方图表示有可能提高图像质量,并有更大的信心样本的组合在风暴成像过程。有没有一个放之四海而皆准的方法来采集数据,因为有许多不同的商业和自建显微镜配置,都可以使用。此外,有许多样品制备和图像采集步骤,它可以十字形ENCE因此最终图像有软件工具和测试样本是理解和优化暴风影音图像质量的关键。
另外,这些协议可以提供故障排除任何可能出现的问题,有用的和更加明确的方式。例如葡聚糖样品,以确定是否有任何的激光束对准或样品的照度不均匀一个非常有用的方法。如果有顾虑,开关缓冲区可能无法正常工作非常简单直观的测试,看看是否有任何'闪烁'会有所帮助。肌动蛋白丝是采用半高宽比较,以及突出的漂移和错误定位工件测量分辨率的有效途径。然而,应该指出的是,作为定位基础的超分辨率的方法可以是荧光团密度敏感,尽管其他因素,如曝光时间,帧速率,激光功率和图像处理方式,它是不可能分配一个分辨率为特别是显微镜和假设所有的图像都会有该决议。这是可能的,但是,是测量分辨率的各个方面,例如平均定位精度,定位数和漂移27。即使基准标记不能被纳入每一个实验,他们可以,至少,可以用来表征显微镜系统,它的环境和更好地了解运作方面的考虑,如多少时间才能达到热平衡启动后。以及校正横向漂移,基准标记可用于表征和正确的轴向漂移,虽然这要求使用一个象散透镜和反馈机制来纠正样本位置而被获取的图像43。商业超分辨率系统通常包括某种形式的稳定控制或聚焦锁定机构,其可以是用于校正焦点偏移的更实际的解决方案。
有再替代非特异性镀膜玻璃用葡聚糖,如直接使用染料或其它共轭分子,如第二抗体。这些方法的局限在于不知道分子结合于玻璃的数量。已经使用的另一种纤维结构,包括微管28和21的DNA。然而,非常小的尺寸和方便的市售试剂的结合,使肌动蛋白的有吸引力的替代,特别是发散或支长丝的间隔距离也可以是系统性能27的有用的测量。
有余地测试样品的进一步发展,尽管在这一领域28,29,46,47最近进展。特别是,多彩色成像提出了许多挑战在成像的全部3个主要方面,样品标记,图像采集(硬件)和软件(图像处理和对准)。有一个被一些出版物寻址这些方面4-6,因此很清楚,合适的测试样品和方法是对生成并可靠地解释这些类型的图像的关键。事实上,最近它表明,dSTORM可以用来采取两种彩色图像,并解决,核孔复合体的高度对称的性质,作者认为,这将是评估的色差校正45性能的理想方法。另一个有趣的方法是利用DNA折纸的创建nanoruler,这在特定的子衍射的距离相隔46创建定位的荧光团的可能性。这提供了评估分辨率,使测量距离的一种方式。然而,最终的目的是将这些超分辨率技术适用于非理想化的样品,如细胞,这是复杂的三维结构。在这种情况下,更透彻的了解吨的组合他技术结合软件工具,帮助用户在获取数据,以适当的方式处理它,并提供图像指标很可能是最终的答案。28,29,47,48
The authors have nothing to disclose.
我们承认资金来自英国国家计量局的化学和生物计量程序。我们感谢塞巴斯蒂安面包车林德加德,米克洛什Erdelyi和埃里克·里斯的技术咨询和建议。我们感谢米克洛什Erdelyi,埃里克·里斯和最大Ryadnov的有益的意见和对这个稿件的讨论。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Labtek Imaging chamberglass | Fisher | CBR-166-390E | Sample preparation |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | * See below for alternatives |
100 X TIRF Objective Lens | Olympus | UAPON 100XOTIRF | * See below for alternatives |
EMCCD Camera | Andor | iXon 897 | * See below for alternatives |
640 nm laser | Toptica | iBEAM-SMART-640-S | *150 mW – for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes |
LabVIEW | National Instruments | *Acquisition software (controlling hardware) | |
PC | Dell | Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing | |
ImageJ | Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
rainSTORM | Laser Analytics Group (Cambridge) software | http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources | |
MATLAB | Running rainSTORM | http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/ | |
*Example of self-built STORM/PALM microscopes | Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope | ||
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes | Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes | ||
Table 1. Materials & Equipment | |||
[header] | |||
PBS (10X) | Fisher | VX70013065 | 1; 2; 3; 4 |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | 1.1; 2.1 |
Dextran-Alexa fluor 647 | Invitrogen | D-22914 | 1.2 |
General actin buffer | Cytoskeleton Inc | BSA01 | 2.2 |
Preformed-actin filaments | Cytoskeleton Inc | AKF99 | 2.2 |
Phallodin-Alexa fluor 647 | Invitrogen | A22287 | 2.2 |
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron) | Invitrogen | T-7279 | 3.1 |
HeLa cells | ATCC | CCL-2 | 4.1 |
DMEM | Fisher | VX31966021 | 4.1 |
FBS | Fisher | VX10500064 | 4.1 |
Pen/Step | Invitrogen | 15070063 | 4.1 |
Plastic dishes | Invitrogen | 734-0006 | 4.1 |
EGF – Alexa fluor 647 | Invitrogen | E35351 | 4.3 |
BSA | Sigma | A7906 | 4.3, 4.4 |
Formaldehyde – 10% solution EM grade | Polysciences | 04018-1 | 4.2 |
Catalase | Sigma | C100 | 5.1 |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | 5.1 |
KCl | Sigma | P9541 | 5.1 |
TCEP | Sigma | C4706 | 5.1 |
Tris | Sigma | 93352 | 5.1 |
Glucose | Sigma | C7528 | 5.2 |
MEA-HCl | Sigma | M6500 | 5.3 |
Glycerin | Sigma | G2289 | 5.1; 5.2 |
Table 2. Reagents |