JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Экспертиза синаптических пузырьков переработка Использование FM Красители Во вызвали, спонтанный, и миниатюрных Synaptic деятельности

Published: March 31, 2014
doi:
10.3791/50557
, , , ,
1Department of Molecular Physiology & Biophysics,University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry,University of Bath

Summary

Мы описали использование стирил FM красителей к фотографиям синаптической переработки пузырьков в функциональных нервных окончаний. Этот протокол может быть применен не только к вызвала, но и спонтанным и миниатюрные синаптические деятельности. Протокол расширяет множество синаптических событий, которые могут быть эффективно оценены.

Abstract

Синаптические пузырьки в функциональных нервных окончаний пройти экзоцитоза и эндоцитоза. Это синаптической переработки пузырьков может быть эффективно проанализированы с использованием стирил FM красители, которые показывают оборот мембраны. Обычные протоколы для использования FM красителей были разработаны для анализа нейроны следующее стимулированного (вызывали) синаптической активности. В последнее время протоколы стали доступны для анализа FM сигналы, которые сопровождают более слабые синаптические мероприятия, такие как спонтанных или декоративные синаптических событий. Анализ этих небольших изменений в ЧМ-сигналов требует, чтобы система визуализации достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в интенсивности, пока что артефактом изменения большой амплитуды подавлены. Здесь мы опишем протокол, который может быть применен к вызывали, спонтанный, и миниатюрные синаптические деятельности, и использовать культивированный нейронов гиппокампа в качестве примера. Этот протокол также включает в себя средство оценки темпов фотообесцвечивания FM красителей, так как это является важнымисточником артефактов при визуализации небольшие изменения в интенсивности.

Introduction

Функциональность синаптических пузырьков является важным фактором, определяющим синаптической передачи. Эти пузырьки выпустить нейротрансмиттеров, когда они сливаются с пресинаптической мембраны плазмы (экзоцитоза), и они становятся готовы к следующему циклу выпуска после возрождается из плазматической мембраны (эндоцитоза) и перезагружается нейромедиатора. Исследование динамики и механизмов, лежащих в основе синаптической переработки пузырьков была значительно ускорен путем введения стирил FM красителей 1. Эти амфипатические молекулы, которые положительно заряженные гидрофильные группы головы и гидрофобные хвосты (несколько красителей на фиг.1А, stereoview из FM1-43 в рисунке 1b), может обратимо входить и выходить из липидные мембраны без проникая их. Группы FM красителей имеют сходные черты, которые влияют на выбор света, который они излучают. Например, FM2-10, FM1-43, и FM1-84 имеют одну двойную связь между двумя циклических соединений и шож зеленый выбросов. Различие между ними есть длина гидрофобной хвоста, который определяет его гидрофобности и поэтому скорость выхода из мембраны (departitioning). В случаях FM5-95 и FM4-64, три двойные связи связать циклические соединения, и они показывают красного излучения. Эти красители отличаются в отношении их гидрофильных частей. Во всех FM красителей, интенсивность флуоресценции возрастает, когда они вставляются в биологические мембраны, в связи с увеличением квантового выхода в гидрофобной среде по отношению к гидрофильной среде. Таким образом, изменения в интенсивности FM представляют изменения в обороте мембраны. Различные цвета (спектры излучения) и гидрофобностей сделать FM красители универсальный исследовательский инструмент в синаптической переработки пузырьков.

Исходя из этих особенностей, то FM красители в основном используются в соответствии со следующей схемой при анализе синаптической переработки везикул (рис. 2). Нейронс купаются в внеклеточного раствора, содержащего FM красителя, что позволяет ему быть взят на синаптических пузырьков (SVS), поскольку они формируют с помощью эндоцитоза (окрашивание). Краситель затем вымываются нанесением раствора внеклеточный красителей; это показывает, функциональные нервные окончания, т.е. только тех, кто активно проходит эндоцитоз будет содержать кластер синаптических пузырьков, которые загружаются с красителем (рис. 2 внизу). После экзоцитоз приводит к потере красителя FM во внеклеточное пространство и сопутствующей потерей флуоресценции (обесцвечивани; как за счет departitioning к гидрофильной среде и диффузии вдали от места экзоцитоза). Поэтому изменения в интенсивности флуоресценции FM являются индикаторами синаптических пузырьков экзо-и эндоцитоза.

FM красители были использованы для окрашивания и destain синаптические везикулы в различных организмов и препаратов 2,3. Примеры включают Neur млекопитающихрных культуры 4-9, млекопитающих ломтики мозга 10,11, нервно-мышечных синапсах 12,13, сетчатки биполярные нейроны 14,15 и волосковые клетки улитки 16.

Как правило, в таких экспериментах, как окрашивание и обесцвечивани вызваны широко стимулируя нейроны (вызывали активности). Однако в последнее время синаптической переработки пузырьков в ответ на слабый стимуляции также были проанализированы, как и утилизации в отсутствие внешнего стимула (спонтанное и миниатюрный синаптической активности) 9,17-19. Спонтанные и миниатюрные синаптические деятельности определяются как те, которые происходят в отсутствие внешних раздражителей, с бывшим участием спонтанное стрельбу из потенциалов действия (рис. 3). Эти слабые синаптические действия, связанные с небольших изменений в ЧМ-сигналов, чем те, вызваны обширной стимуляции. Измерение требует, чтобы изменения в FM fluorescИнтенсивность ENCE точно отражают синаптических пузырьков экзоцитоза или эндоцитоз, но не артефактом изменения в интенсивности. Одной из причин артефакта является наличие неспецифическое окрашивание плазматической мембраны ЧМ красителей. Постепенное вымывание этого компонента приведет к постепенному изменению измеряемой интенсивности флуоресценции, который будет ошибочно приписывают синаптических деятельности. Этот фактор может быть уменьшена с помощью соответствующих методов (см. протокол). Наиболее заметным причиной артефакта является фотообесцвечивания FM красителя сохраняется в синаптических пузырьков. Изменения Фотообесцвечивания связанных в FM интенсивности должно быть мало по сравнению с биологическими (синаптических) изменений, которые оцениваются. Недавнее развитие чувствительных камер, например, электрон-умножения прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры, позволяет свести к минимуму фотообесцвечивания за счет сокращения времени экспозиции и ослабление интенсивности света, используемого для возбуждения флуорофора. Еще одной причиной артефакта является дрейф ян фокусировки уровень светового микроскопа. В центре дрейф во время сеанса изображения может быть вызвано механическими или термическими эффектами, и будет ошибочно привести к изменению интенсивности флуоресценции, измеренной.

Здесь мы описываем протоколы и оборудование, которые делают возможным использование FM красителей для анализа синаптической переработки везикул даже в контексте слабой или вообще без стимуляции, в частности, миниатюрные синаптической активности. Мы показываем примеры окрашивания и обесцвечивани пузырьков во время вызвала и спонтанных синаптических событий, используя культивируемых нейронов гиппокампа грызунов, и отображения фазы обесцвечивани. Мы также продемонстрируем, как оценить степень фотообесцвечивания красителя FM, в отсутствие каких-либо потерь FM красителя из-за синаптических деятельности.

Protocol

1. Первичная культура нейронов от млекопитающих мозг Все животные процедуры, выполняемые в данном исследовании утверждаются Институциональная уходу и использованию животных комитета в Университете штата Айова по. Подготовьте диссоциированную клеточную культур…

Representative Results

В качестве примера, мы покажем репрезентативные результаты для обесцвечивани времени конечно синаптических пузырьков (рис. 4). Культивированный нейронов гиппокампа окрашивали FM4-64 с помощью спонтанного синаптической активности (шаг 2.3) и промывают раствором красителя без (пол…

Discussion

Мы описали протоколы для окрашивания и обесцвечивани синаптических пузырьков в ответ на вызванные, спонтанное и миниатюрный синаптической активности, и для работы с изображениями на этапе обесцвечивани. В дополнение к существующим протоколам, мы включили новый протокол наблюдения о?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность членам лаборатории Harata за полезные обсуждения по всему исполнения этой работы. Эта работа финансировалась за счет грантов от Американской ассоциации сердца, Медицинский исследовательский фонд дистония, Эдвард Mallinckrodt, младший Foundation, Национальный научный фонд, а Уайтхолл Foundation в NCH

Materials

Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm  This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. . Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305 (2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146 (2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34 (2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Tags

Synaptic Vesicle RecyclingFM DyesEvoked Synaptic ActivitySpontaneous Synaptic ActivityMiniature Synaptic ActivityMembrane TurnoverHippocampal NeuronsPhotobleaching

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image