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Abstract
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Neuroscience

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

Published: March 31, 2014
doi:
10.3791/50557
, , , ,
1Department of Molecular Physiology & Biophysics,University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry,University of Bath

Summary

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。

Abstract

機能的な神経終末におけるシナプス小胞は、エキソサイトーシスとエンドサイトーシスを受ける。このシナプス小胞の再利用を効果的に、膜ターンオーバーを明らかにするスチリルFM色素を用いて分析することができる。 FM色素の使用のための従来のプロトコルは、刺激（誘発）次のニューロンシナプス活性を分析するために設計した。最近では、プロトコルは、このような自発的またはミニチュアシナプスイベントなどの弱いシナプス活動を、同行のFM信号を分析するために利用可能となっている。 FM信号のこれらの小さな変化の分析は、撮像​​システムは、強度の小さな変化を検出するのに十分な感度でありながら大振幅の人為的変化が抑制されることを必要とする。ここでは、誘発するために適用することができるプロトコルで、自発的な、そしてミニチュアシナプスの活動を説明し、一例として、培養海馬ニューロンを使用しています。これは重要なので、このプロトコルは、FM色素の光退色率を評価する手段が組み込まれて成果物のソース強度の小さな変化を画像化する。

Introduction

シナプス小胞の機能は、シナプス伝達の重要な決定因子である。彼らは、シナプス前細胞質膜（エキソサイトーシス）と融合すると、これらの小胞は、神経伝達物質を放出し、それらは、細胞膜（エンドサイトーシス）から再生し、神経伝達物質がリロードされた後にリリースの別のサイクルのための準備が。のダイナミクスとシナプス小胞のリサイクルのメカニズムの研究が大幅にスチリルのFM染料1を導入することによって加速されています。積極的に親水性の頭部基と疎水性尾部を充電しているこれらの両親媒性分子は、（ 図1A、図1BにFM1-43の立体像における複数の色素）は、可逆的にそれらを透過することなく、脂質膜を出入りすることができます。 FM色素のグループは、彼らが発する光の範囲に影響を与える類似の特徴を共有しています。例えば、FM2-10、FM1-43、FM1-84は、2つの環状化合物との間の証つの二重結合を有するW緑色発光。両者の違いは、その疎水性を決定し、従って、膜からの出口速度が（departitioning）疎水性尾部の長さである。 FM5-95およびFM4-64の場合では、3つの二重結合は、環式化合物をリンクし、それらは、赤色発光を示す。これらの染料は、それらの親水性の部分に関して異なる。それらは親水性環境に疎水性環境の相対量子収率の増加により、生体膜に挿入されるときに、すべてのFM色素は、蛍光強度が増加する。従ってFM強度の変化は、膜ターンオーバーの変化を表す。異なる色（発光スペクトル）と疎水性は、FMは、シナプス小胞のリサイクリングにおける多目的な研究ツールを染色します。

シナプス小胞のリサイクル（ 図2）を分析する際に、これらの特徴に基づいて、FM色素は、主に以下のスキームに従って使用される。ニューロンsが、それらがエンドサイトーシス（染色）を介して形成するように、シナプス小胞（のSV）中に取り込まれることを可能にする、FM色素を含有する細胞外溶液に浸されている。染料は、その後、色素のない細胞外溶液を適用することにより洗浄されるが、これはすなわちだけ積極的に受けているエンドサイトーシスは、色素（ 図2下）がロードされ、シナプス小胞のクラスターが含まれています機能性神経終末を、明らかにしている。その後のエキソサイトーシスは、細胞外空間に、FM色素の損失と蛍光の付随する損失につながる（脱色;により親水性環境へのdepartitioning離れエキソサイトーシスのサイトからの拡散の両方に）。そのためのFM蛍光強度の変化は、シナプス小胞のエキソサイトーシスとの指標である。

FM色素は様々な生物および製剤2,3におけるシナプス小胞を染色し、脱色するために使用されている。例としては、哺乳動物のneurを含める文化4-9、哺乳類の脳スライス10,11、神経筋接合部12,13、網膜双極ニューロン14,15、および蝸牛16の有毛細胞onal。

通常、このような実験で、染色や脱色の両方を広範囲にニューロン（誘発活性）を刺激することにより誘発される。外部刺激（自発的な、ミニチュアシナプス活性）9,17-19がない場合にリサイクルを持っているとして、最近、しかし、弱い刺激に応答してシナプス小胞のリサイクルも、分析されている。自発的かつ小型のシナプス活動は、活動電位の自然発火（ 図3）を含む前者で、外部刺激の非存在下で発生するものとして定義される。これらの弱いシナプス活動は、広範囲の刺激によって誘発比べFM信号における小さな変化に関連している。測定は、FMの変化ことを必要とfluorescリファレンスの強さを正確にシナプス小胞エキソサイトーシスまたはエンドサイトーシスが、強度の人為的ではない変化を反映する。アーティファクトの原因の一つは、FM色素による細胞膜の非特異的染色の存在である。この成分の漸進的なウォッシュアウトが誤ってシナプスの活動に起因する測定された蛍​​光強度の緩やかな変化につながる。この因子は、（プロトコルを参照）適切な方法によって低減することができる。アーティファクトの最も顕著な原因は、シナプス小胞の内部に保持FM色素の光退色である。 FMの強度の光退色に関連した変化が測定される生物学（シナプス）の変化と比較して小さくなければならない。 例えば、電子増倍電荷結合素子（EMCCD）カメラ感度カメラの最近の開発は、露光時間を短縮し、フルオロフォアを励起するために使用される光の強度を弱めることにより、光退色を最小限にすることが可能となる。アーティファクトのもう一つの原因は、ドリフトIですN光学顕微鏡の焦点のレベル。イメージングセッションの間に焦点ドリフトは、機械的または熱的効果によって引き起こされることができ、誤って測定された蛍​​光強度の変化につながる。

ここで我々はそれが可能で、特に、小型のシナプス活性、微弱または無刺激の文脈においてシナプス小胞のリサイクルを分析するためにFM色素を使用することを可能にするプロトコルおよび装置を記載している。我々は、培養した齧歯類海馬ニューロンを用いて、誘発された自発的シナプス事象中の小胞の染色および脱色の例を示しており、脱色相を撮像する。我々はまた、シナプスの活動へのFM色素の損失がない場合には、FM色素の光退色の程度を評価する方法を示します。

Protocol

1。哺乳動物の脳からの初代培養神経細胞この研究で実行されたすべての動物の手順は、アイオワ大学の制度的動物実験委員会によって承認されています。 生後0-1 19,20にマウスまたはラットから海馬のCA3-CA1領域の解離した細胞培養を準備します。 12mmのカバースリップ（厚さ数0）にプレート海馬細胞は、ラット神経膠細胞フィーダー層で、24ウェル皿に、…

Representative Results

一例として、我々は、シナプス小胞の脱染色の時間経過（ 図4）のための代表的な結果を示す。培養海馬ニューロンは自発的シナプス活性（ステップ2.3）を使用して、FM4-64で染色し、染料を含まない溶液（溶液2すすぎ）で洗浄した。イメージングは、自発的な活動（ステップ5.3）、（連続線の最初の部分、 図4A）を使用して、初期の脱色時間経過を示す。これは、120…

Discussion

私たちは誘発、自発的な、ミニチュアシナプス活動に応答してシナプス小胞を染色し、脱色用、および脱色段階中の画像化のためのプロトコルを記載している。既存のプロトコルに加えて、我々は小型のシナプス活性に基づいて、FM脱色を観察する新しいプロトコルを含んでいた。これらのプロトコルを使用して、我々は以前に運動障害、ジストニアのモデルマウスから培養ニューロンにお?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、この作業の実行中有用な議論のために原田研究室のメンバーに感謝。この作品は、米国心臓協会、ジストニア医学研究財団、エドワード·マリンクロット·ジュニア財団、全米科学財団、およびNCHのホワイトホール財団からの補助金によって賄われていた

Materials

Pulse generator AMPI Master-8
Isolated stimulator Digitimer DS3
Inverted microscope Nikon Eclipse TS100 This is used for assessing the cell morphology at low magnification.
Inverted microscope Nikon Eclipse TiE This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.
Objective lens Nikon Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. >10 μm).
Filter cube Nikon 77032509 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43
Filter cube Nikon 77032809 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64. 
EMCCD camera Andor Technology iXon EM+ DU-860 This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.
Liquid recirculating chiller Solid State Cooling Systems Oasis 160 This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80°C, and thereby reducing noise.
LED CoolLED-Custom Interconnect 490 nm  This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.
Image acquisition software Andor Technology Solis
Imaging chamber Warner Instruments RC-21BRFS
Fast perfusion system Warner Instruments SF-77B
CNQX Tocris Bioscience 1045
D,L-AP5 Tocris Bioscience 0106
Tetrodotoxin Tocris Bioscience 1069 Caution: toxic reagent. Handle with care.
FM1-43 Invitrogen T35356
Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX) Invitrogen F35355
FM4-64 Invitrogen T13320
Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX) Invitrogen F34653
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Hanks’ balanced salt Sigma-Aldrich H2387
Minimum Essential Medium Invitrogen 51200-038 This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Caution: toxic reagent. Handle with care.
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
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Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities. J. Vis. Exp. (85), e50557, doi:10.3791/50557 (2014).
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