A Human<em> Ex Vivo</em> Atherosklerotischen Plaque Modell zur Läsion Biologie studieren

Summary

Atherosklerose ist ein chronischer Entzündungsprozess. Diese Handschrift veranschaulicht eine einfach zu ex-vivo-Modell verwenden, um frische carotis oder koronare Herz Plaques zu untersuchen. Die ex vivo-Modell erlaubt die Untersuchung möglicher Substanzen auf die entzündlichen Milieu in menschlichen arteriosklerotischen Läsionen und die Ergebnisse können mit verschiedenen Verfahren untersucht werden.

Abstract

Atherosklerose ist eine chronische entzündliche Erkrankung der Blutgefäße. Es gibt verschiedene Methoden, um die Entzündungs ​​Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu studieren. Mausmodelle sind ein wichtiges Instrument, um entzündliche Prozesse in der Atherogenese zu untersuchen, aber diese Modelle leiden unter der phänotypischen und funktionellen Unterschiede zwischen der murinen und humanen Immunsystems. In-vitro-Zellexperimenten verwendet werden, um gezielt auswerten Zelltyp-abhängigen Veränderungen durch eine Substanz verursacht Interesse, aber kulturabhängigen Schwankungen und die Unfähigkeit, den Einfluss von spezifischen Molekülen im Rahmen der Entzündungs ​​Verbindung in atherosklerotischen Läsionen zu analysieren begrenzen die Auswirkungen der Ergebnisse. Zusätzlich Messen der Werte eines Moleküls von Interesse in menschlichen Blut hilft weiter zu untersuchen ihrer klinischen Relevanz, aber dies stellt keine systemische und lokale Entzündungen. Deshalb beschreiben wir eine Gedenktafel Kulturmodell der menschlichen atherosklerotischen Läsion Biologie studierenex vivo. Kurz, frisch Plaques aus Patienten, die Endarteriektomie oder koronaren Bypass-Operation erhalten und in RPMI-Medium auf Eis bis zur Verwendung gelagert. Die Proben werden in kleine Stücke, gefolgt von statistischer Verteilung in eine 48-Well-Platte geschnitten, enthaltend RPMI-Medium zusätzlich eine Substanz von Interesse, wie Cytokine oder Chemokine, allein oder in Kombination für definierte Zeiträume. Nach der Inkubation können die Plaquestücke Schock für die mRNA-Isolierung eingefroren werden, in Paraffin oder Oktober für die Immunhistochemie Färbung eingebettet oder zerschlagen und Western-Blot-lysiert. Ferner können Zellen, die aus der Tafel für die Durchflußzytometrie-Analyse isoliert werden. Darüber hinaus können die Überstände für die Protein Messung durch ELISA gesammelt werden. Abschließend öffnet sich das vorgestellt ex vivo-Modell die Möglichkeit, entzündliche läsionaler Biologie, die bei der Identifizierung von Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Ziele führen kann weiter studieren.

Introduction

Atherosklerose als eine chronische entzündliche Krankheit ist eine der Haupttodesursachen in den Industrienationen ^02.01. Komplikationen der Arteriosklerose, insbesondere akutem Koronarsyndrom, haben zum Bruch der gefährdeten Läsionen in Verbindung gebracht worden, was zu Atherothrombose und Gefäßverschluss ^3. Angeborenen und erworbenen Immunität scheint bei allen Schritten von ^2,4-5 Atherogenese beteiligt sein. Obwohl bedeutende Fortschritte in der Behandlung von Herzinfarkt, eine wirksame Prävention von Arteriosklerose und kardiovaskulären Nebenwirkungen gemacht worden sind noch ungelöst. So studieren läsionaler Biologie ist wichtig für die Erhöhung unserer Kenntnisse über die Pathophysiologie der Atherosklerose und die Identifikation neuer therapeutischer Targets und Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen.

In vielen Fällen werden murine Modelle verwendet, um die Pathophysiologie von spezifischen Krankheiten zu untersuchen. , Studium der Atherogenese mit Maus-Modellen ist jedoch accodurch mehrere Einschränkungen mpanied: (1) In der Regel erhalten atherosklerotischen Mäusen einen hohen Cholesterin-Diät. Der Cholesterinspiegel in diesen Modellen nicht mit denen bei Patienten mit erhöhten Cholesterin-Serumspiegel ⁶ verglichen werden. (2) Es gibt erhebliche Unterschiede zwischen den murinen und humanen Immunsystem; somit Foxp3 ist ein spezifischer Marker für Maus-regulatorischen T-Zellen, wohingegen menschliche Foxp3-Expression in humanen T-Zellen nicht unbedingt eine regulatorische Phänotyp verleihen ^7. Auch die Th1/Th2 Paradigma wie beim Menschen ist nicht definiert, um Maus-T-Zellen vollständig übertragbar. (3) Eine Reihe von Markern, die verwendet werden, um murine Monozyten und Makrophagen, wie F4/80 und Markierungen der klassischen (M1) zu identifizieren vs Alternative (M2) Aktivierungsmuster nicht in der menschlichen myeloischen Zellen ⁸ vorhanden. (4) Gene Expression des murinen und humanen Monozyten im peripheren Blut wurde gefunden, wesentlich ⁹ sein.

So, um unser Verständnis von erhöhenchronische Entzündungsprozesse im menschlichen Atherosklerose, müssen wir den Einsatz von Modellen der Arbeit mit menschlichen Gewebe, Blut oder Zellen zu machen. Hier beschreiben wir ein Modell der menschlichen Plaquegewebe Kultur, die Untersuchung möglicher neuer Substanzen in das Konzept der menschlichen Entzündungs ​​läsionaler Biologie ermöglicht.

Protocol

1. Bereiten Medium wie folgt Kulturmedium: RPMI-Medium. Werden 10% fötalem Kälberserum (FCS). Mit 100 U / ml Penicillin G und 100 g / ml Streptomycin. 2. Lagerung von frischen Plaque Zylinder bis zur Verwendung Die Karotis-Endarteriektomie Betrieb von Patienten mit oder ohne ischämische Symptome (Schlaganfall, transitorische ischämische Attacke) mit einer signifikanten Karotisstenose werden von Gefäßchirurgen und koronare Herz Endarteriek…

Representative Results

Hier präsentieren wir eine Reihe von Figuren, die Ergebnisse der Ex-vivo-Plaque Kultivierung demonstrieren. Änderungen in der entzündlichen Umgebung in Reaktion auf das Mittel von Interesse in der ex-vivo-Modellexperiment beurteilen, messen wir verschiedene Moleküle, die bekannt sind in erster Linie in der Atherogenese beteiligt werden. Als Vertreter pro-atherogenen Zytokine wir wählen TNFa, IL-6 und IFNg 2,11. Darüber hinaus verwenden wir von-Willebrand-Faktor und Gewebefaktor pro-thr…

Discussion

Hier präsentieren wir eine Ex-vivo-Plaque-Kultur-Modell, um den Einfluss der potenziell relevanten Substanzen auf atherosklerotische Läsion Biologie zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser ex vivo-Verfahren ist die Möglichkeit, den Einfluß der genannten Stoffe auf Entzündungszellen und ihre Wechselwirkung zellulärer sowie Entzündungswege und Kaskaden innerhalb der menschlichen atherosklerotischen Läsionen zu beurteilen. Mehrere nutzbare Methoden (zB RT-PCR, Western-Blot, Immunhistochem…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Gibco	21875-091	n/a
FCS	Gibco	10270-106	n/a
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458	n/a
15 ml tube	Sarstedt	62,554,502	n/a
culture dish (60mm)	Orange Scientific	5550200	n/a
LPS	Sigma	L4516	n/a
Cell Culture Plates 48-well	Greiner	677102	n/a
Scalpel – single use	Feather	FEA200130011	n/a
TissueLyser	Precellys 24 Dual	Cat. No. EQ03119.200.RD010.0	n/a
RNeasy (Mini) Kit	Qiagen	Cat. No. 74104	n/a
Boehringer cDNA kit	Roche Diagnostics	Cat. No. 11483188001	n/a
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific		n/a