Wir beschreiben Modelle der mittelschweren und schweren Ischämie-Reperfusion-induzierte Nierenschädigung, in denen die Mäuse unterziehen einseitige renale Stiel Klemm gefolgt durch gleichzeitige oder verzögerte kontralaterale Nephrektomie sind. Diese Modelle konsequent führen zu Nierenfunktionsstörungen und posttraumatische Fibrose, aber Verletzungsschwere und Überleben sind abhängig von Maus Hintergrund, Alter und chirurgischen Einrichtungen.
Ischämie-Reperfusion akuten Nierenschädigung (AKI-IR) wird weithin als ein Modell der AKI in Mäusen verwendet, aber die Ergebnisse sind oft sehr variabel mit hohen, oft nicht gemeldet Sterblichkeit, die Analysen verwechseln kann. Bilaterale renale Stiel Klemmung wird häufig verwendet, um IR-AKI induzieren, aber die Unterschiede zwischen effektiver Klemme Drücke und / oder renalen Reaktionen auf Ischämie zwischen Nieren oft mehr variable Ergebnissen führen. Darüber hinaus werden kürzere Klemme mal bekannt, mehr variable tubuläre Schädigung induzieren, während Mäuse und unterziehen bilateralen Verletzungen mit längeren Klemme mal konsequenter tubuläre Schädigung entwickeln sie oft innerhalb der ersten 3 Tage nach der Verletzung wegen schwerer Niereninsuffizienz sterben. Um nach der Verletzung das Überleben zu verbessern und zu erhalten mehr konsistente und vorhersagbare Ergebnisse, haben wir zwei Modelle der einseitigen Ischämie-Reperfusion Verletzungen durch kontralaterale Nephrektomie gefolgt entwickelt. Beide Operationen werden durchgeführt unter Verwendung eines dorsalen Zugang, wodurch chirurgischen Stress durch from ventralen Laparotomie, die gemeinhin für Maus IR-AKI Operationen verwendet. Für die Induktion der mittleren Verletzungen BALB / c Mäusen zu unterziehen einseitiger Einspannung des renalen Stiel für 26 min unterzogen und gleichzeitig kontralaterale Nephrektomie. Mit diesem Ansatz entwickeln 50-60% der Mäuse moderate AKI 24 Stunden nach der Verletzung, aber 90-100% der Mäuse überleben. Um weitere schwere AKI induzieren, unterziehen BALB / c Mäusen Nieren Stiel Klemmung für 30 min durch kontralaterale Nephrektomie 8 Tagen nach Verletzungen gefolgt. Dies ermöglicht funktionelle Beurteilung der Nierenfunktion Genesung nach Verletzungen mit 90-100% Überleben. Frühe posttraumatische Tubulusschäden sowie nach der Verletzung Fibrose sind sehr konsistent mit diesem Modell.
Eine Vielzahl von experimentellen Modellen der akuten Nierenschädigung (AKI) wurden entwickelt, um die Vielfalt und Komplexität des menschlichen Daseins (siehe Referenz für eine aktuelle, umfassende Überprüfung 1) entsprechen. Jedes dieser Modelle hat seine eigenen Stärken und Schwächen, und während jeder ahmt die entsprechenden menschlichen Bedingungen mit unterschiedlichen Wirkungsgraden, keine präzise Modellierung der Pathophysiologie von ihren menschlichen Pendants. Ischämie Reperfusion (IR)-induzierten AKI als Modell von akuter Ischämie-induzierter Nierenschädigung in Nagetieren entwickelt. Während die Schwere der Schädigung der Nierentubuli in diesem Modell zu sehen ist selten bei Patienten mit renaler Minderdurchblutung Verletzungen 2 beobachtet, trotz ihrer Einschränkungen und vor allem wegen der relativ reproduzierbare Natur dieses Modells seines umfangreichen Einsatzes hat vorgesehen, und es wird erwartet, wird weiterhin wichtige Erkenntnisse über viele der gemeinsamen grundlegenden Mechanismen der AKI, Reparatur und Therapie 3 vorzusehen. IR Chirurgie erfordert familiarity mit der Maus Niere Anatomie, die wir in einer vereinfachten Form in Abbildung 1 dargestellt sind. Renal Ischämie-Reperfusion (IR) Verletzungen Operation kann über ventralen (Bauchschnitt) oder dorsal (retroperitoneale) Ansätze durchgeführt werden. Wir verwenden eine dorsale Ansatz, da es weniger traumatisch ist, so dass eine schnellere Genesung und eine verbesserte Überlebensrate (insbesondere, wenn das Erlernen der ersten Prozedur). Renal IR Verletzung kann einseitig oder beidseitig erfolgen. Dies führt jedoch Unterschiede zwischen effektiver Klemme Druck (die von Zwischenschaltung perihiläre Fett zwischen den Spannbacken führen) und / oder Unterschiede in der renalen Ischämie zwischen Reaktionen auf Seiten mehr unterschiedliche Ergebnisse. Zwar ist dies kein unüberwindbares Problem, kann es Variabilität zwischen den Experimenten zu erhöhen, das ist ein großes Problem für dieses Modell. Einseitige IR mit contra-lateraler Nephrektomie durchgeführt werden. Dies ist unsere Methode der Wahl, da es reduziert Variabilität Klemmung zwischen Pedikel und gleichzeitig einllows man beurteilen Nierenfunktion, die unberührt mit einseitiger IR allein ist. Es wurde darüber diskutiert, was ist die praktischste vs optimale Methode, um die Nierenfunktion bei Mäusen zu beurteilen. Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) liefert ein Maß für die Nierenfunktion und ist ein nützlicher "ersten Blick" Marker in einigen Modellen von AKI, einschließlich IR Verletzungen. Allerdings kann BUN Ebenen Vol. Status der Mäuse, die betroffen sein könnten betroffen sein, insbesondere nach ventralen Zugang IR Verletzungen, wenn verzögerte Erholung reduziert orale Aufnahme von Flüssigkeiten für eine Anzahl von Tagen nach der Operation. Serum-Kreatinin wird weniger durch Flüssigkeitszufuhr Status beeinflusst, sondern ist eindeutig durch Muskelmasse beeinflusst. Eine der Schwierigkeiten, mit Serum-Kreatinin-Messungen hat Probleme mit dem Nachweis der Nicht-Kreatinin Chromogene in Maus-Serum mit Pikrinsäure Techniken. Alternativ haben einige Zentren eine HPLC-basiertes Verfahren zur Maus Kreatinin quantifizieren, die nicht von diesem Artefakt 4 betroffen ist entwickelt. Allerdings unlike BUN und Kreatinin-Pikrinsäure-Assays, die nur verlangen 5-10 ul Serum, erfordern HPLC-Assays ~ 25 ul Serum pro Test, die, wenn sie in doppelte durchgeführt wird ~ 100 ul Vollblut pro Assay benötigt. Dies kann Mäusestudien limitierend sein. Einige Zentren haben empfindlichere HPLC und Massenspektrometrie-basierte Methoden, die Analyse kleiner Probenvolumina 5, 6 ermöglichen entwickelt. Allerdings sind diese Techniken nicht allgemein verfügbar. Eine Alternative, enzymatische Kaskade Assay (was nur 5-10 ul Serum) wurde in Maus und Ratte Serumproben wurden ausgewertet und gezeigt, dass eng parallel HPLC-Messungen von Serum-Kreatinin während Pikrinsäure-Assays immer überschätzen Kreatinin-Werte 7. Während dieser Test ist nicht weit verbreitet in der AKI Literatur verwendet wird, ist der Test im Handel erhältlich, einfach zu bedienen, und wir finden, gibt zuverlässige Ergebnisse mit diesem Modell von IR-induzierten AKI in Mäusen.
Wir beschreiben zwei Modelle der IR-AKI, um die Auswirkungen von mittelschweren und schweren Nierenschädigung zu studieren. Diese ermöglichen uns die konsistente und vorhersagbare Verletzungen mit geringer Sterblichkeit zu induzieren. Unser Protokoll beschreibt viele der Schwierigkeiten und Fallstricke traditionell mit diesem Modell verbunden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass abhängig von der Länge der renalen Stiel Klemmung, das Modell eine weitgehend reversible milde und moderate AKI oder mehr schwere AKI i…
The authors have nothing to disclose.
Dr. de Caestecker Labor wird durch NIH 1RO1 HL093057-01 und 1RC4DK090770-01 unterstützt. Dr. Harris 'Labor wird durch DK38226, DK51265, DK62794 und Finanzierung von der Veterans Administration unterstützt. Unterstützung für Maus Nierenschädigung Operationen, Serum-Kreatinin und Fibrose Assays auch von der Vanderbilt O'Brien Kidney Injury-Center Zuschuss 1P30 DK079341 vorgesehen.
Drug or solution | Company | Catalogue number | Comments |
Ketamine (anesthetic) | Webster Veterinary | 07-881-9413 (100 mg/ml) | Final concentration 30 mg/ml Ketamine with 3 mg/ml Xylazine administered at 3-4 ml/kg (100 mg/kg Ketamine and 10 mg/kg Xylazine) |
Xylazine (analgesic) | Webster Veterinary | 07-808-1939 (100 mg/ml) | As above |
Antisedan (anti-Xylazine) | Webster Veterinary | 07-867-7097 (5 mg/ml) | Optional: to reverse effects of Xylazine in order to increase the rate of recovery after surgery Use 0.5-0.7 mg/kg |
Buprenorphine (analgesic) | Bedford Laboratories | NDC 55390-100-10 (0.3 mg/ml) | Dose 0.05-0.1 μg/g every 8-12 hr. Make up a 1:5 dilution in sterile normal saline preoperatively and give 2.5-5 μl/g of the diluted solution. |
Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
Betadine swab sticks | Purdue Products L.P. | NDC 67618-153-01 | |
Nolvasan Surgical Scrub | Pfizer Animal Care | 300253 | |
Table 2. Drugs and solutions for I/R surgery. | |||
Iris Scissors | Integra Miltex | VWR 21909-404 | For skin and muscle dissection |
Curved iris forceps | FST | 11065-07 | To hold skin and muscle, to remove peri-nephric fat |
Blunt forceps | ROBOZ | RS-5228 | To manipulate kidneys |
Vascular clamp (795 g pressure) | ROBOZ | RS-5459 | Good for C57BL/6 and BALB/c mice strains |
Schwartz clip applying forceps | ROBOZ | RS-5450 | For RS-5459 clamps |
Vascular clamp (75-85 g pressure) | FST | 18055-02 | Optimal for CD1 mice strain, but also can be used for C57BL/6 and BALB/c |
Micro-Serrefine Clamp Applicator-14 cm with Lock | FST | 18056-14 | For FST 18055-02 clamps |
Gayman T/Pump (water-bath heated platform) | Braintree Scientific | TP-650 | The water heater is set at 38 °C 1 hr prior surgery |
15″ W x 24″ Heated platform | Braintree Scientific | HHP-2 | Connect to Gayman heated water pump |
Heating pad | Braintree Scientific | Model 39DP | Uses microwave for heating. This is useful for warming during recovery |
Absorbable suture (Vicryl 5-0) | ETHICON | VCP834G | For fascia and muscle |
Non-absorbable suture: monofilament nylon MONOMID 6/0 660B) | CP Medical | CP-B660B-03 | For skin |
Halsey needle holder: Tungsten Carbide/13 cm | FST | 12501-13 | To hold suture needles |
Timer | FST | 06-662-3 | To quantify ischemia time |
Hot bead sterilizer | FST | 18000-45 | To sterilize instruments between mice if you are performing multiple surgeries (it is not sufficient to soak instruments in ethanol) |
Electric razor | Braintree Scientific | CLP-22965 | |
Tape | Durapore | 1538-0 | |
1 ml Syringe | EXELint | 26044 | |
Sterile cotton tipped applicators | Kendall | 8884541300 | |
Absorbent BenchPad | VWR | 56617-014 | |
Surgical drapes | VWR | 21902-985 | Need to be autoclaved |
2” x 2” Gauze Pads | Medi-First | 60673 | |
Sterile gloves | Cardinal Health | 2D7251 | |
Table 3. Equipment and instruments for I/R surgery. |