Mejora de la preparación y conservación de las rebanadas de hipocampo de un ratón de grabación muy estable y reproducible de la potenciación a largo plazo
Summary
En este trabajo se presenta una metodología completa para preparar y conservar<em> In vitro</em> Cortes de hipocampo agudos de ratones adultos. Este protocolo permite la grabación de la potenciación a largo plazo duradera muy estable (LTP) durante más de 8 horas con una tasa de éxito del 95%.
Abstract
Potenciación a largo plazo (LTP) es un tipo de plasticidad sináptica que se caracteriza por un aumento en la fuerza sináptica y cree que está involucrado en la codificación de la memoria. LTP suscitó en la región CA1 de cortes de hipocampo agudos se ha estudiado ampliamente. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la fase de mantenimiento de este fenómeno son aún poco conocidos. Esto podría deberse en parte a las diversas condiciones experimentales utilizadas por diferentes laboratorios. En efecto, la fase de mantenimiento de la LTP es fuertemente dependiente de los parámetros externos, como la oxigenación, temperatura y humedad. También depende de los parámetros internos como orientación del plano de corte en lonchas y viabilidad rodaja después de la disección.
La optimización de todos estos parámetros permite la inducción de una potenciación muy reproducible y muy estable a largo plazo. Esta metodología ofrece la posibilidad de explorar más a fondo los mecanismos moleculares implicados en el aumento estableen la fuerza sináptica en rebanadas de hipocampo. También destaca la importancia de las condiciones experimentales de investigación in vitro de los fenómenos neurofisiológicos.
Introduction
Hoy en día, hay una comprensión limitada de cómo se almacenan y recuperan en el plano del circuito neuronal recuerdos complejos. Sin embargo, una hipótesis unificadora de almacenamiento de memoria está disponible y ampliamente aceptado: memorias se almacenan como los cambios en la fuerza de las conexiones sinápticas entre neuronas en el sistema nervioso central. Por su parte, la investigación sobre la plasticidad sináptica se ha beneficiado en gran medida a partir de dos grandes descubrimientos. (1) En un experimento seminal, Bliss y Lomo 1, usando el conejo anestesiado intacta, encontraron que la entrega de un breve de alta frecuencia (1 seg, 100 Hz) la estimulación de la vía perforante del hipocampo causó una larga duración (varias horas) el aumento de las conexiones sinápticas relacionadas. Este fascinante fenómeno se llama "potenciación a largo plazo" o LTP por Douglas y Goddard en 1975 2. (2) Posteriormente, se encontró que un fenómeno similar podría ser activado en rodajas de cerebro (0,4 mm) mantenida artificialmente en activo in vitro </em>. La LTP más ampliamente estudiado se observó in vitro mediante la entrega de uno o varios tetani a un haz de axones (los llamados colaterales de Schaffer) durante la grabación del campo de potencial sináptico excitatorio resultante evocado en las neuronas piramidales de la llamada región CA1. Los mecanismos de inducción de LTP en gran medida han sido revelados. Básicamente, un influjo de Ca2 + a través de los receptores de NMDA activa las enzimas con dos consecuencias: una fosforilación de los receptores AMPA (lo que aumenta su eficiencia) y una incorporación de los receptores AMPA supletorias en la membrana postsináptica 3. Por el contrario, los mecanismos de la fase de mantenimiento de la LTP son en gran parte desconocidos, en particular debido a que es experimentalmente mucho más difícil mantener una rebanada saludable para muchas horas de durante 30 a 60 min.
Una gran cantidad de estudios se han dedicado a la comprensión de los mecanismos de LTP y teorías interesantes han sido elaborados durante los años 4-11. Pero sinhasta ahora, los mecanismos moleculares precisos que subyacen en el aumento estable en la fuerza sináptica no se han dilucidado. Esto podría deberse en parte a la dificultad de reproducir los resultados anteriores en distintos laboratorios, utilizando diferentes técnicas para la preparación y el mantenimiento de los cortes de hipocampo. En su documento sobre la metodología, Sajikumar et. Al 12 hizo hincapié en la importancia de las condiciones experimentales para la preparación de rodajas de hipocampo de rata y el registro de LTP estable. En este video se presenta todos los pasos de optimización desarrollados en nuestro laboratorio en los últimos años para poder grabar una LTP muy estable en rodajas de hipocampo de ratón.
Esta optimización se ha realizado a partir de protocolos desarrollados y utilizado con éxito por otros laboratorios que estudian los mecanismos de LTP en ratones y ratas 13 11. Se permite a los investigadores experimentados para inducir y grabar un LTP duración muy larga en ratones adultos con una alta tasa de éxito. El physiological base de la LTP inducida fue comprobado cuidadosamente y demostró 14. En este documento sobre la metodología, se muestra que las modificaciones de las condiciones experimentales, como la temperatura o la oxigenación pueden tener un profundo impacto en el mantenimiento LTP, mientras que el procedimiento de disección puede modificar profundamente rebanadas excitabilidad. También debe hacerse hincapié en que el control preciso de todos estos parámetros requiere una formación de varios meses para los estudiantes novatos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado en nuestro laboratorio un protocolo resultante de la combinación de los métodos desarrollados y utilizados por otros laboratorios que tienen una gran experiencia en la LTP grabaciones 11,17. Este protocolo está adaptado para adultos hipocampo del ratón y se puede utilizar en animales de cualquier edad y de cualquier genotipo fondo. También permite el análisis de LTP en ratones transgénicos en desarrollo las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer 18,19.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Bernard Foucart de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Belga para la Investigación Científica (FRS-FNRS) y por el Fondo de la Reina Elisabeth de Investigación Médica. Agnès Villers es Investigador Asociado en el Fondo Belga para la Investigación Científica.
Materials
| Reagent/Material | |||
| NaCl | Sigma – Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma – Aldrich | S8875 | |
| KCl | Sigma – Aldrich | P9333 | |
| D-glucose | Sigma – Aldrich | G7528 | |
| NaH2PO4 | Sigma – Aldrich | S9638 | |
| MgSO4 1M | Sigma – Aldrich | 63126 | |
| CaCl2 | Sigma – Aldrich | C4901 | |
| Carbogen | Air Liquide (Belgium) | ||
| Capillaries | WPI, Inc. (UK) | TW150-4 | |
| Stimulating Electrodes | FHC (USA) | CE2B30 | |
| Surgical tools | FST (Germany) | ||
| Filter paper 84 g/m2 | Sartorius | FT-3-105-110 | |
| Mesh | Lycra | 15 den | |
| Glue | UHU | plus endfest300 | |
| Instrument | |||
| Amplifier | WPI, Inc. (UK) | ISO-80 | |
| Interface recording chamber | FST (Germany) | ||
| Peristaltic pumps | Gilson (USA) | Minipuls 3 | |
| Temperature controller | University of Edinburgh | www.etcsystem.com | |
| Tissue Chopper | Mcllwain | ||
| Stimulators | Grass (USA) | S88X + SIU-V | |
| Program analysis | WinLTP | www.winltp.com | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 and MMO-220A | |
| Surgical microscope | Leica Microsystem | ||
| A/D converter | National Instruments | NIPCI-6229 M-series |
References
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