Summary

Melhoria da preparação e preservação de fatias do hipocampo de camundongos para uma gravação muito estável e reprodutível de potenciação de longa duração

Published: June 26, 2013
doi:

Summary

Este trabalho apresenta uma metodologia completa para se preparar e preservar<em> In vitro</em> Fatias de hipocampo agudos de ratos adultos. Este protocolo permite a gravação de potenciação de longa duração de longa duração muito estável (LTP), durante mais de 8 horas, com uma taxa de sucesso de 95%.

Abstract

A potenciação de longa duração (LTP), um tipo de plasticidade sináptica, caracterizada por um aumento na força sináptica e acredita estar envolvida na codificação da memória. LTP provocada na região CA1 do hipocampo fatias agudas tem sido extensivamente estudada. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a fase de manutenção deste fenômeno ainda são pouco compreendidos. Isto pode ser em parte devido às várias condições experimentais utilizadas por laboratórios diferentes. Com efeito, a fase de manutenção da LTP é fortemente dependente de parâmetros externos como a oxigenação, temperatura e humidade. É também dependente dos parâmetros internos como orientação do plano de corte e de viabilidade após a dissecação fatia.

A optimização de todos estes parâmetros permite a indução de potenciação de uma muito reprodutível e muito estável a longo prazo. Esta metodologia oferece a possibilidade de explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento estávelna força sináptica em fatias de hipocampo. Ele também destaca a importância das condições experimentais na investigação in vitro de fenômenos neurofisiológicos.

Introduction

Hoje em dia, há uma compreensão limitada de como as memórias complexas são armazenados e recuperados no nível do circuito neuronal. No entanto, uma hipótese unificadora de armazenamento de memória disponível e largamente aceites: memórias são armazenadas como variações na força das conexões sinápticas entre neurónios no sistema nervoso central. Por si só, a pesquisa sobre a plasticidade sináptica foi amplamente beneficiado com duas descobertas revolucionárias. (1) Num experimento seminal, Bliss e Lomo 1, utilizando o coelho anestesiado intacto, descobriram que a entrega de uma breve alta frequência (1 s, 100 Hz), a estimulação do caminho perfurante do hipocampo causada uma longa duração (vários horas) aumento das conexões sinápticas relacionadas. Este fenômeno fascinante foi chamado de "potencialização de longo prazo", ou PLP por Douglas e Goddard, em 1975 2. (2) Mais tarde, verificou-se que um fenómeno semelhante poderá ser desencadeada em fatias de cérebro (0,4 mm), mantido artificialmente vivo, in vitro </em>. A LTP mais amplamente estudados foi observado in vitro, fornecendo um ou vários tetani a um feixe de axónios (os chamados colaterais de Schaffer) durante a gravação do campo resultante sináptica excitatória potencial evocado nos neurónios piramidais da região CA1 chamada. Os mecanismos de indução da LTP têm sido amplamente revelados. Basicamente, um influxo de Ca2 + através dos receptores NMDA activa enzimas com duas consequências: a fosforilação de receptores AMPA (o que aumenta a sua eficiência) e uma incorporação de receptores de AMPA extra na membrana pós-sináptica 3. Por outro lado, os mecanismos da fase de manutenção da LTP são em grande parte desconhecida, nomeadamente porque é experimentalmente muito mais difícil manter uma fatia saudável durante muitas horas de 30 a 60 min.

Muitos estudos têm sido dedicados à compreensão dos mecanismos de LTP e teorias interessantes foram elaborados ao longo dos anos 4-11. Mas unaté agora, os mecanismos moleculares exactos subjacentes ao aumento estável na força sináptica não foram elucidados. Isto pode ser parcialmente devido à dificuldade para reproduzir os resultados obtidos em laboratórios diferentes, utilizando diferentes técnicas para a preparação e para a manutenção de fatias do hipocampo. Em seu papel metodologia, Sajikumar et al. 12 ressaltou a importância das condições experimentais para a preparação de fatias de hipocampo de ratos e ao registo das LTP estável. Neste vídeo, apresentamos todas as etapas de otimização desenvolvidos em nosso laboratório ao longo dos anos para poder gravar um LTP muito estável em fatias de hipocampo de ratos.

Essa otimização foi feita a partir de protocolos desenvolvidos e utilizados com sucesso por outros laboratórios que estudam mecanismos de LTP em camundongos e ratos 13 11. Ele permite que os investigadores experientes para induzir e gravar uma LTP duradoura por muito tempo em ratos adultos com uma alta taxa de sucesso. O pbase hysiological da LTP induzida foi cuidadosamente verificada e demonstrada 14. Neste trabalho a metodologia, vamos mostrar que qualquer modificação das condições experimentais, como a temperatura ou a oxigenação pode ter um impacto profundo sobre a manutenção LTP enquanto o procedimento de dissecção pode modificar profundamente fatias excitabilidade. Também deve ser enfatizado que o controle preciso de todos estes parâmetros requer um treinamento de vários meses para os alunos novatos.

Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o National Institutes of regulamentos de saúde para o cuidado e uso de animais em pesquisa e com o consentimento do comitê de ética local. 1. Preparação de Artificial líquido cefalorraquidiano Os mesmos meios de comunicação é utilizado para dissecar, cortar e perfundir fatias (1 ml / min) durante o período de repouso e as gravações eletrofisiológicas. Este meio é composto por NaCl 124 m…

Representative Results

Esta metodologia foi utilizada para analisar as propriedades de potenciação de longa duração a longo prazo induzida em fatias de hipocampo agudas a partir de ratos adultos (C57Bl/6J JANVIER SAS, França) 14. Surpreendentemente, a melhoria das condições experimentais levou a uma nova forma de olhar para a LTP. Nós mostramos que o aumento de longa duração em sináptica não exigem a síntese de novas proteínas. Aqui, vamos mostrar que a indução de LTP depende fatias de v…

Discussion

Temos desenvolvido no nosso laboratório um protocolo que resulta da combinação de métodos desenvolvidos e utilizados por outros laboratórios têm uma grande experiência na LTP gravações 11,17. Este protocolo é adaptado para hipocampo do rato adulto e pode ser usado em animais de qualquer idade e qualquer genótipo de fundo. Ele também permite a análise da LTP em camundongos transgênicos desenvolvimento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer 18,19.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Bernard Foucart para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo Belga para a Investigação Científica (FRS-FNRS) e pelo Fundo Rainha Elisabeth de Pesquisa Médica. Agnès Villers é pesquisador do Fundo Belga para a Investigação Científica.

Materials

      Reagent/Material
NaCl Sigma – Aldrich S7653  
NaHCO3 Sigma – Aldrich S8875  
KCl Sigma – Aldrich P9333  
D-glucose Sigma – Aldrich G7528  
NaH2PO4 Sigma – Aldrich S9638  
MgSO4 1M Sigma – Aldrich 63126  
CaCl2 Sigma – Aldrich C4901  
Carbogen Air Liquide (Belgium)    
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4  
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30  
Surgical tools FST (Germany)    
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110  
Mesh Lycra 15 den  
Glue UHU plus endfest300  
      Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80  
Interface recording chamber FST (Germany)    
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3  
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com  
Tissue Chopper Mcllwain    
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V  
Program analysis WinLTP www.winltp.com  
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A  
Surgical microscope Leica Microsystem    
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series  

References

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Cite This Article
Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).

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