Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Summary

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Abstract

Cultura de células tem melhorado muito a nossa capacidade de avaliar populações individuais de células sob condições de cultura inumeráveis. Enquanto as linhas de células imortalizadas oferecem vantagens significativas para a sua facilidade de utilização, estas linhagens de células não estão disponíveis para todos os tipos de células potenciais. Ao isolar as células primárias a partir de uma região específica de interesse, particularmente a partir de um ratinho transgénico, os estudos mais matizadas podem ser executadas. A técnica básica envolve a dissecção do órgão ou órgãos parcial de interesse (por exemplo, do coração ou de uma região específica do coração) e dissociação do órgão para células individuais. Estas células são então incubadas com contas magnéticas conjugadas com um anticorpo que reconhece o tipo celular de interesse. As células de interesse pode então ser isolado, com a utilização de um íman, com uma curta incubação de tripsina dissociar as células dos grânulos. Estas células isoladas podem ser cultivadas e, em seguida, analisado como desejado. Esta técnica foi originalmente concebido para órgão do rato adultos, mas podem ser facilmente reduzidos para uso com os órgãos embrionários, como aqui demonstrado. Porque o nosso interesse é na vasculatura coronária em desenvolvimento, que queria estudar esta população de células em fases embrionárias específicas. Assim, o protocolo original teve de ser modificado para ser compatível com a pequena dimensão dos ventrículos embrionárias e o baixo rendimento potencial das células endoteliais para estas fases de desenvolvimento. Utilizando essa abordagem em escala reduzida, avaliamos coronária remodelação plexo nas células endoteliais ventriculares embrionárias transgênicos.

Introduction

O advento das linhas de células imortalizadas revolucionou a biologia das células de base ^1. As linhas de células actualmente disponíveis são derivados de uma vasta gama de órgãos e abrangem todos os principais tipos de células. No entanto, as linhas celulares estabelecidas têm algumas limitações. O processo de imortalizao, obviamente, alterar o comportamento das células, especialmente no que diz respeito ao tempo de vida e a proliferação, mas também pode afectar a expressão de proteínas inesperadas, tais como as proteínas do citoesqueleto ^2. Além disso, apesar de muitas linhas celulares diferentes estão disponíveis, existe uma diversidade significativa mesmo entre um único tipo de células dentro de um organismo inteiro. As células endoteliais em particular mostra diversos comportamentos com base em se elas linha de artérias ou veias e que tipo de fluxo está presente no recipiente ^3. Ainda mais premente de uma perspectiva do desenvolvimento, no entanto, é que a maioria das linhas celulares disponíveis são derivados de tecidos de adulto (veja, por exemplo, tele coleção disponível via ATCC). Estas linhas de células adultas provavelmente não recapitular a natureza dinâmica dos seus precursores embrionários. As rápidas mudanças espaciotemporais padrões de expressão de genes durante o desenvolvimento, também observadas sugerem que uma célula endotelial de um órgão num determinado estágio de desenvolvimento pode não se comportam da mesma maneira como uma célula endotelial, a partir desse mesmo órgão, numa fase de desenvolvimento diferente.

Como uma alternativa ao uso comercialmente disponíveis linhas celulares imortalizadas, as células primárias podem ser isoladas a partir do tecido de interesse específica. Entre as vantagens desta técnica, essas células primárias podem ser isolados a partir de um órgão específico ou mesmo parte de um órgão, em qualquer fase de desenvolvimento específico. Além disso, essas células primárias podem ser isolados a partir da grande variedade de animais transgénicos disponíveis, permitindo o estudo in vitro do gene knockout e knock-in, evitando outros problemas, tais como a eficiência da transfecção. Não surpreendentemente, muitostécnicas têm sido publicados detalhando como isolar tipos específicos de células ^{a 4,5.} Em geral, estas técnicas envolvem a recolha na região de interesse, a dissociação das células, de etiquetagem do tipo de célula específico de interesse, e isolando as células para análise posterior.

Para estudar uma população embrionária das células endoteliais coronárias, que foi reduzida a ⁴ técnica previamente publicada para o uso com um órgão menor. Com este procedimento, em escala reduzida, pode-se isolar as células endoteliais coronárias do coração embrionário em estágios embrionários específicos. Estas células podem depois ser utilizados em ensaios endoteliais tradicionais, tais como análises de migração. Até linhagens de células embrionárias precoces tornam-se mais prevalente, trabalhando com as pilhas é uma técnica inestimável.

Protocol

1. Preparar anticorpos conjugados grânulos Um dia antes da dissecação, combinar o anticorpo de escolha com as Dynabeads apropriadas (por exemplo IgG de rato Dynabeads para um anticorpo criado em ratos, 4 x 10 8 contas / ml), segundo as instruções do fabricante. Para o rato anti-CD31 anticorpo BD (0,5 mg / mL, utilizados para isolar as células endoteliais), 3 ul de anticorpo é adicionado a cada 25 ul de pérolas, para uma concentração final de 1,5 ug de anticorpo anti-CD31 e 1 x 10…

Representative Results

Usando um anticorpo específico para o endotélio, que reconhece CD31, as células endoteliais foram isolados a partir dos ventrículos embrionárias (E), 13,5 (Figura 1A) e 18.5 (Figuras 1B-1D) embriões. Quando cultivado em um prato de cultura não tratada, essas células permanecem arredondado e que formam um padrão de paralelepípedos se perto confluente (Figura 1A). Diluir colagénio também foi utilizado para revestir os poços, e as células endoteliais, enquant…

Discussion

Trabalhando com células embrionárias primárias permite novas experiências para abordar em passos críticos do desenvolvimento in vitro. No entanto, o procedimento de isolamento não é trivial. Passos críticos para o isolamento de qualquer tipo de células, nomeadamente, assegurar que as células são bem separados por digestão com colagenase e depois que eles são bem suspensa durante os passos de lavagem. Dissecção mecânica por pipetagem contribui grandemente separar as células durante a et…

Materials

			REAGENTS
Timed-pregnant mice			To be dissected at the embryonic stage of interest
Anti-mouse CD31	BD Bioscience	553370
Rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Collagen	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Collagenase, type I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Endothelial cell growth medium	(made in lab as described in notes)		DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140
Trypsin-EDTA	Gibco	25300
384-well culture plate	Greiner	T-3037-6	Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2
Collagen type I	BD	354236	Use at a final concentration of 1.5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Used as directed in 13
			EQUIPMENT
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
Cell culture incubator	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Table-top centrifuge	Thermo	75002430