胚胎心室血管内皮细胞的分离
Summary
原代细胞培养是一个非常有用的技术分析特定的细胞群体，在特定的发展阶段，特别是从转基因小鼠胚胎。这里，胚胎脑室解剖的和离解，抗体共轭的有孔玻璃珠的识别和分离出来的血管内皮细胞进行进一步的分析。
Abstract
细胞培养，大大提高了我们的能力，评估个人的无数文化条件下的细胞群体。永生化的细胞系提供了其易用性的显着的优点，这些细胞系对所有潜在的细胞类型是不可用的。隔离从一个特定的感兴趣区域的，特别是来自转基因小鼠的原代细胞，可以进行更细致的研究。的基本技术包括解剖的器官或部分感兴趣的器官（ 例如心脏或心脏的特定区域）和单细胞解离的器官。与磁珠结合到感兴趣的细胞类型的抗体，该抗体识别这些细胞，然后进行培养。感兴趣的细胞然后可以使用磁铁进行分离，解离的细胞从有孔玻璃珠和一个短的胰蛋白酶孵育。在这些分离的细胞可以被培养，分析的需要。这种技术最初是专为成年小鼠器官，但也可以很容易地缩小与胚胎器官的使用，本文所证明。因为我们的兴趣是在发展中国家的冠状动脉血管，我们想研究这个细胞群体，在特定的胚胎阶段。因此，原始的协议进行修改，以兼容胚胎脑室的小尺寸和低电位在这些发育阶段的血管内皮细胞的产率。利用这种按比例缩小的方法，我们已经评估冠状动脉丛转基因胚胎心室重构的内皮细胞。
Introduction
永生细胞系的问世彻底改变基本细胞生物学1。当前可用的细胞系是来自于广泛的器官，包括所有的主要细胞类型。然而，建立的细胞系有一定的局限性。永生化的方法，明显改变细胞的行为，特别是相对于寿命和扩散，而且还可以影响意想不到的蛋白质的表达，如细 胞骨架蛋白2。此外，虽然有许多不同的细胞系，甚至一个单一的细胞类型内的整个有机体之间的显着的多样性。内皮细胞在特定的显示出不同的行为根据他们是否行动脉或静脉，是什么样的流量目前在容器3。更为迫切，但是，从发展的角度来看是可用的细胞系中，绝大多数是来自成人组织（ 如：T他收集可通过ATCC）。这些成人细胞株可能不复述他们的胚胎前体的动态性质。迅速变化的时空在开发过程中观察到的基因表达模式也表明，在给定的发育阶段从一个器官的血管内皮细胞，可能无法从该相同的器官，血管内皮细胞在不同发育阶段的行为方式相同。
作为一种替代方法，使用市售的永生化细胞系，原代细胞可以分离出感兴趣的特定组织。在这种技术的优点，这些原代细胞可以分离出特定的器官，或什至在任何特定的发育阶段的器官的一部分。此外，这些原代细胞可以从可用的转基因动物的各种各样的分离， 从而允许该基因敲除和爆震的同时避免了其他问题，如转染效率的体外研究。毫不奇怪，许多技术已出版，详细介绍了如何分离特定的细胞类型4,5。一般情况下，这些技术涉及收集感兴趣的区域，解离的细胞，感兴趣的特定的细胞类型进行标记，并分离这些细胞进行进一步的分析。
要研究冠状动脉内皮细胞的早期胚胎人口，我们缩减先前公布的技术4，使用一个较小的器官。有了这个比例缩小的过程中，我们可以分离出冠状动脉内皮细胞从胚胎心脏特异性胚胎阶段。这些细胞可以被用在传统的内皮细胞的检测，如迁移分析。直至早期胚胎细胞系变得更加普遍，工作与原代细胞是一个非常宝贵的技术。
Protocol
Representative Results
Discussion
初级胚胎干细胞工作，让新颖的实验来解决发展在体外关键的步骤。然而，分离过程中是不平凡的。隔离任何类型的细胞的关键步骤包括确保细胞分离后，胶原酶消化，然后，他们悬浮在洗涤步骤。机械清扫通过移液大大有助于细胞分离在胶原酶步骤，过滤步骤除去细胞团块。这些措施提高人口的纯度和产量。
电镀密度也是一个显着的关注，从一个小器官分离细胞时?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢Andrea波尔特布里的，批判性阅读的手稿，显微镜服务UNC援助与时间推移成像实验室，以及美国国立卫生研究院（授＃R01HL061656）的资金支持。
Materials
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercaptoethanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 |
References
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