Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem anlatılmaktadır<em> In situ</emTek-molekül çözünürlükte tek hücrelerde mRNA sayım için> Hibridizasyon (FISH).
In situ Hibridizasyon Floresans (FISH) yöntemi bir yerli hücresel ortamda nükleik asitler algılamasını sağlar. Burada tek maya hücrelerinde mRNA sayısı ölçmek için FISH kullanmak için bir protokol sağlar. Hücreler ilgi herhangi bir durumda yetişen ve daha sonra sabit ve geçirgen yapılabilir. Daha sonra, floresan boyalar ile konjuge birden fazla tek sarmallı deoxyoligonucleotides mRNA etiket ve görselleştirmek için kullanılır. Tek mRNA moleküllerden kırınım-sınırlı floresan hücre başına mRNA sayısını belirlemek ve saymak için bir nokta algılama algoritması kullanılarak ölçülür. Kuzey benekleri, RT-PCR ve gen ekspresyonu microarrays daha standart ölçme yöntemleri toplu popülasyondaki ortalama mRNA hakkında bilgi sağlamak da, balık tek molekül çözünürlükte tek bir hücre içinde sayım ve bu mRNA lokalizasyonu hem de kolaylaştırır.
Toplu ölçüm teknikleri kullanarak, bu tahlil tek hücre içinde 1 transkriptleri veya transkripsiyonel aktivitesinin sayısını mümkün değildir. Gen ifadesinin gazetecilere gibi ilgi rehberleri tarafından yönlendirilen floresan proteinleri kullanarak bir ölçüde bu sorunu gidermek, ancak kat floresan proteinleri için gerekli zaman erken dinamikleri gizler olabilir. Uzun ömürlü floresan proteinleri de mRNA yaşam rapor edemez. FISH yöntemi ve tek molekül çözünürlüğe sahip, çekirdekte transkripsiyon başlangıcından itibaren tek bir hücre içinde daha sonraki olgunlaşma ve çürümeye, onun bütün ömrü boyunca tahlilinde mRNA için kullanılabilir.
DNA elemanları soruşturma radyoaktif RNA prob kullanılan nükleik asitlerin görselleştirmek için yerinde deneylerde orijinal. Bu kurbağa Xenopus laevis 2 ve fare doku 3 uydu DNA yumurtalıklarda ribozomal DNA görselleştirme dahil. Yerinde exper ilk floresaniment Özellikle DNA dizilerinin 4 soruşturma için bir fluorofor ile işaretlenmiş bir RNA molekülü kullanılır. In situ RNA görselleştirmek için floresan probları ilk uygulama tavuk kas dokusu kültürü 5 aktin geni ifade görselleştirme oldu. Daha yakın zamanlarda, tomurcuklanan maya, BALIK maya metabolik döngüsü 6 sırasında transkripsiyon salınımlar araştırmak için kullanılmıştır, hücre döngüsü ilerlemesi 7 ve mitoz 8 sırasında mRNA transkript mekansal lokalizasyonu sırasında mRNA'ların çürüme. BALIK daha fazlasını maya genlerinin yarısından oluşturan yapısal olarak transkripsiyonu gen bölgesi ilintisiz dalgalanmalar ilintisiz transkripsiyon başlatma 9 ortaya olduğunu göstermek için maya kullanılmaktadır. Olmayan maya türlerde, BALIK fare bağırsak 10 kök-hücre belirteçleri tanımlamak için ve hücre kaderi eksik penetrans C. Stokastik gen hareketlerinden kaynaklanabilecek olabilir belirlemek için kullanılmıştırelegans embriyolar 11.
Burada anlatılan yöntem FISH mesajları mRNA'ya dye-etiketli, tek iplikli DNA probları ile hibridize çalışır. Hücreler görüntülü ve mRNA bir nokta tespit algoritması kullanılarak sayılır. Tek sarmallı sondalar bir DNA synthesizer ile oluşturulan ve daha sonra etiketli (Singer probları olarak anılmaktadır) veya ön-etiketli sondalar (Stellaris probları) 12,13 olarak ticari sipariş edilebilir. Singer Stellaris problar arasındaki önemli bir fark, Stellaris sondalar (yaklaşık 20 bp) olarak Raj ve arkadaşları tarafından tarif prob başına sadece tek bir etiket ile kısa süre Singer probları daha uzundur (~ 50 bp) ve multi-etiketli olmasıdır 14. Buna ek olarak, Stellaris yaklaşım Singer (sırasıyla, gen başına yaklaşık 30 karşılık 5 sondaları) daha gen başına çok fazla sonda kullanır. Aşağıda prob ya tip kullanımını açıklayan bir protokol sağlar. Bölüm 2'de, biz amino-alil timidin içeren problar w etiketleme için bir protokol sağlarseçilmiş bir Cy boya ith. MRNA'ya noktaları belirlemek için gereken bilgi işlem adımlarının bir bakış Bölüm 7'de verilmektedir.
Bugüne kadar, BALIK öncelikle düşük verimli yöntem olmuştur. Cy3, Cy3.5 ve Cy5 boyaların kullanımı bir anda üç tek hücrelerde araştırabilirsiniz genlerin sayısını sınırlar. Bazı ek problar geliştirilmiştir (Stellaris) ama ayırt prob sayısı hala en yedi yer almaktadır. Bu sınırlama aşmak için, birden fazla fluorophores kullanarak kombinasyon etiketleme stratejileri farklı mRNA türleri 19,20 için barkod oluşturmak için kullanılmıştır. En son, Lübeck ve Cai tek maya hücreleri 19 FISH ile eş zamanlı olarak 32 farklı türler ölçmek için optik ve spektral barkod kullanılır. Bu son Kombinatoryal yaklaşımın bir sınırlama süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımını gerektirir. Barkodlu probları ayırt etmek için gerekli analiz de oldukça karmaşıktır.
Biz, Cy3 ve Cy3.5 FISH deneyleri için Cy5 tercih olduğunu bulduk. Cy5 boya sınırlamaları biri de duyarlılığı olanphotobleaching için. Ancak, Stellaris son zamanlarda photobleaching karşı daha dayanıklı olarak ilan edilir Cy5 türevleri geliştirdi, ve bu teknik sorunu hafifletmek olabilir. Ticari problar için fiyatları gelecekte azalması gerektiği halde, prob set başına $ 1,000 – Ayrıca bu BALIK dikkati çekiyor uygulamak için pahalı bir yöntemdir ve Singer ve Stellaris hem probları genellikle 700 $ mal olduğunu. Reaktifler ve verimli etiketleme koruyucu fiyat alt aralığı aşağı Singer probları getiriyor.
Büyük teknik zorluklardan biri gelişmiş nokta belirleyici algoritmalarının uygulanmasını gerektirir tek veya çoklu prob noktalar, ayrılmasıdır. Bu özel deney kurulumları için görüntü analiz parametreleri ayarlamak için kapsamlı manuel yorum alabilir. Ilgili MATLAB fonksiyonları ile hesaplama boru hattı bir taslak protokol Bölüm 7'de verilmiştir. Bu sorun biraz sadece var Stellaris sondaları tarafından azaltılabilir edilir prob başına bir etiket. Bu nedenle, bir sinyal görmek için birden fazla prob ko gerektirir.
BALIK hücre sabitleme gerektirir çünkü, zaman içinde izleme tek tek hücrelerin kolaylaştırmak değildir. Daha önce, bireysel metabolik bisiklet maya nüfus 6 gen ifadesinin dinamiklerini yeniden BALIK anlık verileri kullanılmıştır. Metabolik bisiklet önceden aç bırakılmış, sürekli kültürlerde görülmektedir, ve oksijen tüketimi nüfus-çapında bir toplu titreşimler ile karakterize edilir. Bu salınımlar oksijen tüketimi farklı aşamalarında her maya genlerinin yarısını meydana transkript genom titreşimler ile ilişkilidir. Biz metabolik bisiklet eşitlenmemiş sürekli maya kültürleri mevcut olup olmadığını belirlemek için çalıştı. Varsa, senkron nüfus anti-ilişkili olan transkript de ilişkili transkript için eşitlenmemiş tek hücre, ve tersi anti-ilişkili olmalıdır.
ent "zaman içinde mRNA üretiminin dinamiklerini yeniden için>, gözlenen anlık veri temel davranış modeli beklenen ne karşılaştırılmalıdır. gibi ne zaman teorik sınırlamalar vardır" gen ifadesi veri anlık "belirlemek için kullanılabilir temel gen dinamikleri ve hangi modelleri çeşitleri 21 ayırt edilebilir. metabolik döngüsü veri, yerine doğrudan geçici salınımlar varlığını gösteren için, istatistiksel ölçümler toplu mikroarray ile uyumlu bir hücre özerk salınım programı gerçekten var olduğunu kanıtlamak için uygulanmıştır ölçümleri.The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma hibe GM046406 (DB) tarafından ve Sayısal Biyoloji Genel Tıp Bilimleri Merkezi (GM071508) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. RSM NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu fon kabul eder. MNM bir Lewis-Sigler Bursu tarafından desteklenmektedir. Biz metabolik döngüsü projeye katkılarından dolayı yararlı tartışmalar ve eski üyeleri Allegra Petti ve Nikolai Slavov için Botstein laboratuar üyeleri kabul etmek istiyorum. Biz bize FISH yöntemi ile başladı almak için Daniel Zenklusen ve Robert Singer teşekkür ederim.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |