Этот протокол описывает экспериментальную процедуру выполнения флуоресценции<em> На месте</em> Гибридизация (FISH) для подсчета мРНК в одиночных камерах в одной молекулы разрешение.
Флуоресценции в гибридизация (FISH) метод позволяет обнаружить нуклеиновых кислот в клеточной среде родного. Здесь мы предлагаем протокол для использования FISH для количественного определения количества мРНК в отдельные клетки дрожжей. Клетки могут быть выращены в любом состоянии интерес, а затем фиксировали и сделаны проницаемыми. Впоследствии несколько одноцепочечной deoxyoligonucleotides конъюгированные с флуоресцентными красителями используются для маркировки и визуализировать мРНК. Ограниченное дифракцией флуоресценции от одиночных молекул мРНК количественно с использованием точечного алгоритма обнаружения для определения и подсчета количества мРНК в клетке. В то время как более стандартные методы количественной оценки северной пятна, RT-PCR и микрочипов экспрессии генов предоставлять информацию о среднем мРНК в объеме населения, FISH облегчает как подсчет и локализации этих мРНК в отдельные клетки при одной молекулы разрешение.
Использование объемных методов измерения, это не возможно для анализа количества транскриптов или транскрипционную активность в отдельные клетки 1. Использование флуоресцирующих белков обусловлен промоторов интерес в качестве репортеров экспрессии гена может решить эту проблему в некоторой степени, но время, необходимое для флуоресцентного белка сложить скрывает рано динамики. Долгосрочные флуоресцентные белки также не может сообщить мРНК жизней. FISH метод может быть использован для анализа мРНК во время его жизненного цикла, от инициации транскрипции в ядре последующим созреванием и распада в отдельные клетки, с одной молекулы разрешение.
Оригинальный экспериментов на месте для визуализации нуклеиновых кислот использовали радиоактивно РНК-зонды для исследования ДНК элементов. К их числу относятся визуализация рибосомальной ДНК в яичниках лягушки Xenopus Laevis 2 и сателлитной ДНК в ткани мыши 3. Первый флуоресцентный на месте экспериментаiment использовали молекулу РНК отмечены флуорофором чтобы исследовать определенные последовательности ДНК 4. Первым применением флуоресцентных зондов для визуализации РНК на месте была визуализация экспрессии гена актина в мышечных тканях куриных культуры 5. Совсем недавно, в начинающие дрожжи, рыба использовалась для изучения колебаний в транскрипции во время цикла дрожжей метаболических 6, распад мРНК во время клеточного цикла 7 и пространственной локализации транскриптов мРНК во время митоза 8. Рыба была использована в дрожжах, чтобы показать, что некоррелированного колебания конститутивной транскрипции генов, которые составляют более половины всех генов дрожжей, возникают из некоррелированного инициации транскрипции 9. В не-дрожжевых видов, FISH была использована для определения стволовых клеток маркеров в кишечнике мыши 10 и определить, что неполные проницаемость клеточной судьбы могут возникнуть в результате стохастического экспрессии генов колебания C.Элеганс эмбрионов 11.
FISH метод, описанный здесь работает путем гибридизации меченного красителем, одноцепочечной ДНК-зондов мРНК сообщений. Клетки отображаемого мРНК и подсчитывают с помощью точечного обнаружения алгоритма. Одноцепочечных зонды могут быть созданы с помощью синтезатора ДНК и затем метили (называемый здесь Певица зонды) или заказать коммерчески как предварительно меченых зондов (Stellaris зонды) 12,13. Одно из основных различий между певцом и Stellaris зондов, что певец зонды больше (~ 50 б.п.) и мульти-меченных в то время как Stellaris зонды короткие (~ 20 б.п.) только одна метка на зонд, как описано Радж и др. 14. Кроме того, Stellaris подход использует гораздо больше зондов на ген, чем у Singer (~ 30 против 5 зондов на ген, соответственно). Ниже мы приводим протокол, который описывает использование любого типа зонда. В разделе 2, мы предоставляем протокол для маркировки амино-аллил тимидином содержащих зонды Wго выбрали Cy красителя. Обзор вычислительных шагов, необходимых для идентификации одного пятна мРНК приведена в разделе 7.
На сегодняшний день, в первую очередь рыба была низкой пропускной методом. Использование Cy3, Cy3.5 и Cy5 красители ограничивает количество генов можно исследовать на отдельные клетки до трех одновременно. Некоторые дополнительные зонды были разработаны (Stellaris), но количество различимых зондов по-прежнему не более семи. Чтобы обойти это ограничение, комбинаторные маркировки стратегии с использованием нескольких флуорофоров были использованы для создания штрих-кодов для различных видов мРНК 19,20. Совсем недавно, Любек и Цай использоваться оптические и спектральные штриховое кодирование для количественной 32 различных видов одновременно с рыбой в одиночных клетках дрожжей 19. Один из недостатков этого недавнего комбинаторный подход требует использования сверхразрешения микроскопии. Анализ необходимо различать штрих зондов также довольно сложным.
Мы обнаружили, что Cy3 и Cy3.5 предпочтительнее Cy5 для рыб экспериментов. Один из недостатков Cy5 краситель является его чувствительностьк фотообесцвечивания. Тем не менее, Stellaris недавно разработала Cy5 варианты, которые рекламируются как более устойчивы к фотообесцвечивания, и может облегчить это технический вопрос. Также стоит отметить, что рыба дорогая метод для реализации, и что обе певицы и Stellaris зондов обычно стоят $ 700 – $ 1000 за набор зондов, хотя цены на коммерчески доступных зонды должны уменьшаться в будущем. Щадящая реагентов и эффективной маркировки приносит Певица зондов до нижнего диапазона в цене.
Одним из основных технических задач является разделение одного против нескольких зондов пятна, которые требует реализации сложных точечного определения алгоритмов. Это может занять обширный обзор руководства, чтобы настроить параметры анализа изображений для конкретных экспериментальных установок. Схема нашей вычислительной трубопровода с соответствующими функциями MATLAB приведена в разделе 7 Протокола. Этот вопрос несколько облегчены Stellaris пробы, которые обладают только одна метка на зонде. Поэтому требуется колокализации несколькими зондами видеть сигнала.
Поскольку FISH требует фиксации клеток, он не облегчает отслеживание отдельных клеток с течением времени. Ранее мы использовали данные FISH снимок реконструировать динамику экспрессии генов в отдельных метаболически Велоспорт дрожжей населения 6. Метаболический Велоспорт наблюдается в предварительно морили голодом, непрерывными культур, и характеризуется общепопуляционными коллективные колебания в потреблении кислорода. Эти колебания связаны с геном-широкие колебания, которые происходят стенограммы половина всех генов дрожжей на разных этапах потребления кислорода. Мы стремились, чтобы определить, метаболические Велоспорт присутствовал в несинхронизированную непрерывной культуры дрожжей. Если присутствует, стенограмм, которые антикоррелированы в синхронных групп населения также должны быть антикоррелированы несинхронизированную в одиночных камерах, и наоборот для коррелированных транскриптов.
ЛОР "> Для восстановления динамики производства в мРНК время наблюдаемые данные снимка должно быть по сравнению с тем, что ожидается от модели базового поведения. Существуют теоретические ограничения, когда такие" снимки "данных экспрессии генов может быть использован для определения основной динамики экспрессии генов и какие виды моделей можно выделить 21. для метаболического цикла данных, а не непосредственно показывающие наличие временных колебаний, статистические измерения были осуществлены обосновать, что на самом деле существует автономная ячейка колебательные программы в соответствии с объемной микрочипов измерений.The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано грантами GM046406 (к БД) и Национального института общих медицинских наук Центра биологии Количественный (GM071508). RSM признает финансирование из NSF Высшее исследовательский грант. MNM поддерживается Льюиса Сиглера стипендий. Мы хотели бы выразить признательность членам Botstein лаборатории за полезные обсуждения и бывших членов Allegra Петти и Николай Славов за их вклад в метаболический цикл проекта. Мы благодарим Даниэля Zenklusen Роберт Зингер и для того, чтобы нас начали с рыбой методом.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
Vanadyl Ribonucleoside Complex | NEB | S1402S | |
Lyticase | Sigma | L5263 | |
E. coli tRNA | Roche | 1010954001 | |
BSA (RNase free) | Ambion | ||
Beta-mercaptoethanol | Fisher | 03446l | |
DAPI, dilactate | Sigma | D9564 | |
PBS 10X (RNase free) | Ambion | AM9624 | |
Triton X-100 | Shelton Scientific | ||
Dextran sulfate | Sigma | D6001 | Or equivalent |
Saline-sodium citrate (SSC) 20X | VWR | 82021-484 | |
Formamide (deionized) | Ambion | AM9342 | |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | |
Alpha-D-glucose | Sigma | 158968 | For GLOX solution |
1 M Tris-HCl, pH 8.0 | Ambion | AM9855G | |
100% Ethanol | |||
Glucose oxidase | Sigma | G0543 | For GLOX solution |
Catalase | Sigma | C3155 | For GLOX solution |
Concanavalin A | MP Biomedicals | 150710 | |
Polylysine (0.01%) | Sigma | P8920 | |
Coverslips | Warner Instruments | Cs-18R15 | |
Prolong Gold Mounting Medium | Invitrogen | P36934 | |
QIAquick Nucleotide Removal Kit | QIAGEN | 28304 | |
FISH Probes | Biosearch Technologies | Custom order for your desired mRNA sequence | |
Glass bottom 96-well plates | Nunc | 265300 | Alternative to coverslips |
12-well plates | BD Falcon | 351143 | |
Cy3, Cy3.5, Cy5 dyes | GE Healthcare | monofunctional NHS-ester | |
EQUIPMENT | |||
Plasma-Preen I Cleaner | Terra Universal | 9505-00 | Controller (Cat #9505-17 optional) |
Vacuum Pump | Alcatel | 205SDMLAM | For operating Plasma-Preen |
Widefield Fluorescence Microscope | Olympus | IX81 | Or equivalent |
100X objective | Olympus | 1-UB617R | |
Light Source | X-Cite | XCT 10-A | Or equivalent |
Filter Sets | Chroma | U-NSP100V2-SPR, U-NSP101V2-SPR, U-NSP102V2-SPR, U-NSP103V2-SPR,U-NSP104V2-SPR. | |
Cooled CCD or EMCCD Camera | Hamamatsu | C4742-98-24ER |