В естественных нейронных изображений кальция в C. Элеганс
Summary
Имея небольшие прозрачные тела, хорошо документированный нейроанатомию и множество поддаются генетических методов и реагентов,<em> C. Элеганс</em> Является идеальной моделью для организма<em> В естественных условиях</em> Нейронов визуализации с использованием относительно простых, недорогих методов. Здесь мы описываем одно изображение нейрона в интактных животных взрослый с использованием генетически закодирована флуоресцентных индикаторов кальция.
Abstract
Нематоды червя C. Элеганс является идеальной моделью для организма относительно простые, недорогие нейронов изображения в естественных условиях. Его маленький прозрачный корпус и простое, хорошо характеризуется нервная система позволяет идентифицировать и флуоресценции любого нейрона в интактных животных. Простые методы иммобилизации при минимальном воздействии на физиологию животного позволяет увеличить покадровой обработки изображений. Развитие генетически закодированный кальция чувствительной флуорофоры, такие как Cameleon 1 и 2 позволяют GCaMP в естественных изображений нейронов кальцием, касающихся как физиология клетки и активность нейронов. Многочисленные трансгенных линий выражения этих флуорофоров в конкретные нейроны являются доступными или могут быть построены с использованием хорошо известных методов. Здесь мы описываем подробные процедуры для измерения кальция динамику в пределах одного нейрона в естественных условиях, используя как GCaMP и Cameleon. Мы обсудим преимущества и disadvantвозраст обоих, а также различные методы подготовки образцов (животных иммобилизации) и анализа изображений. Наконец, мы представляем результаты двух экспериментов: 1) С помощью GCaMP для измерения сенсорные реакции конкретного нейрона на внешнее электрическое поле и 2) Использование Cameleon для измерения физиологической реакции кальция в нейрон травматического повреждения лазера. Кальций методы визуализации, такие как они широко используются в C. Элеганс и были распространены на измерения в свободном перемещении животных, несколько нейронов одновременно и сопоставления между генетического фона. C. Элеганс представляет собой надежную и гибкую систему в естественных нейронных изображений с преимуществами по сравнению с другими системами модель в технической простоте и стоимости.
Introduction
Здесь мы приведем практические методы в естественных изображений кальция в C. Элеганс нейронов. Развитие генетически закодирована кальций-чувствительных флуорофоров с высоким отношением сигнал-шум делает C. Элеганс сравнительно простой и экономически эффективной системы для измерения нейрофизиологии и деятельности. Наши изображения осуществляется с помощью стандартного микроскопа соединения с использованием широкого поля флуоресценции обычно доступных флуорофоров. Мы представляем несколько методов с использованием различных флуорофоров и различные препараты образца, обсуждая сильные и слабые стороны каждого из них. Затем данные представлены в двух экспериментах пример. Отличный дополнительный ресурс на методы, описанные здесь, можно найти в WormBook, "Imaging активность нейронов и мышц» Р. Керр ( http://www.wormbook.org ) 3.
Два основных классов генетическитически закодирована флуоресцентные журналистам кальция широко используются в C. Элеганс: GCaMP одного канала и FRET на основе Cameleon. Мы опишем методы и показать примеры данных, полученных в каждой.
GCaMP на основе модифицированного зеленого флуоресцентного белка (GFP), который является чувствительным к окружающим концентрации кальция. Это достигается путем слияния GFP и высоким содержанием кальция сродство белка кальмодулина, например, что связывание кальция кальмодулин приносит GFP молекулы в эффективных флуоресцентных подтверждение 2. Последние достижения в этих флуорофоров генерировать исключительные размеры сигнала до 500% увеличение интенсивности флуоресценции более физиологическом диапазоне уровня кальция и достаточно быстро кинетики ~ 95 мс время нарастания и ~ 650 мс Время затухания 4. За сравнительно короткие периоды времени (минуты), эти большие сигналы могут обеспечить более низкое разрешение изображения (нижняя увеличение), и, учитывая хорошо себя инициализацииIAL измерения базовой линии, свести на нет необходимость в непрерывном базовый или сравнительных измерений.
Cameleon имеет то преимущество, что FRET на основе флуорофором, который генерирует радиометрические измерения сравнении двух независимых каналов или длины волны 1. Он состоит из двух отдельных флуорофоров (голубой и желтый-излучающих флуоресцентные белки, CFP и YFP), связанных белка кальмодулина. Комплекс подсвечивается синим светом (440 нм), которые возбуждают CFP. Связывание кальция приводит флуорофоров ближе друг к другу, увеличение флуоресценции резонансного переноса энергии (FRET) от CFP (донора) к YFP (акцептор) и вызывая CFP излучения (480 нм), чтобы уменьшить и YFP излучения (535 нм), чтобы увеличить . Относительный уровень кальция измеряется как отношение YFP / CFP интенсивности. Cameleon кинетики медленнее, чем GCaMP, измеренная в естественных условиях, чтобы иметь время нарастания ~ 1 сек, время затухания ~ 3 сек 5. Тем не менее,отношение противоположно движущиеся сигналы увеличивает размер сигнал и компенсирует число возможных артефактов в связи с изменением концентрации флуорофора, движения или дрейф фокуса и отбеливание.
Генетически закодированный флуоресцентный журналистам отрицают большую часть подготовки образца необходимо с экзогенно вводили зонды и C. Элеганс небольшой прозрачный корпус позволяет изображений в интактных животных с помощью простых широкий флуоресценции поле. Основной технической проблемой в пробоподготовки поэтому безопасно иммобилизации животных. Есть целый ряд различных часто используемых методов каждого свои преимущества и недостатки. Использование фармакологических агентов, чтобы парализовать животных можно легко реализовать и позволяет монтаж нескольких животных на одного препарата (левамизол, холинергические агонисты, которое вызывает мышечную ткань, чтобы захватить как правило, используется 6). C. Элеганс также может быть физически иммобилизованные путем установки ихна жесткий 10% агарозы 7, 8. Это сводит к минимуму воздействие на физиологию животного, позволяет долгосрочное томография (часы) и восстановление нескольких животных, но является более технически сложными. Оба этих метода ограничить физический доступ к животным (которые находятся под крышкой скольжения) и поэтому могут быть использованы только с определенных экспериментальных стимулов (таких, как свет, температура, электрическое поле или лазерного повреждения). Для раздражителей, где физический доступ не требуется, такие как прикосновение или введения химических веществ, многие исследования успешно клееного C. Элеганс на месте (с помощью клея ветеринарной класс) 9. Это технически более сложным, является одним подготовки животного и не позволяют животному восстановления. Наконец, многочисленные микрофлюидных устройства были заняты, что физически сдерживать C. Элеганс, сохраняя физиологии животных, позволяя воздействия большинства видов раздражителей (в зависимости от конструкции прибора) и может позволить быстрого обмена и восстановления животных <sup> 10, 11. Однако микрофлюидики требует дополнительных технических навыков и возможностей в области проектирования, изготовления и реализации. В иммобилизованных животных деятельность и стимул ответ в общем случае может быть измерена в сенсорной и интернейронов. Активность нейронов двигателя требует более сложных методов визуализации в движущихся животных. Здесь мы приведем подробные методы, использующие два наиболее простым методам фармакологической парализации и иммобилизации с жесткой агарозы.
Методы, представленные здесь, могут быть использованы для измерения активности нейронов и клеточной физиологии C. Элеганс. Приведем пример каждого из них: использование GCaMP для измерения сенсорные реакции ASJ нейрона к внешним электрическим полем, и с помощью Cameleon для измерения физиологической реакции кальция лазерного повреждения нейронов. Эти примеры показывают, преимущества и недостатки двух типов флуорофоров и иллюстрируют, что это возможно с системой.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генетически закодированный показатели кальция широко используется в C. Элеганс нейробиологии. Многочисленные группы использовали эти методы для изучения реакции первичных сенсорных нейронов на внешние раздражители, как показано здесь с ответом ASJ к электрическому полю. Известн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Несколько человек участвовал в работе описано в этой статье. CVG построена экспериментальная установка, и LS, SHC, а CVG выполнены эксперименты. CVG и SHC написал рукопись. Все авторы впоследствии приняли участие в процессе пересмотра и утвержден окончательный вариант рукописи. Мы благодарим Павла Штернберга для GCaMP напряжения. Некоторые нематоды штаммы, используемые в этой работе были предоставлены Caenorhabditis генетический центр (CGC), которая финансируется за счет NIH Национальный научно-исследовательский центр ресурсов (NCRR). Анализ изображений MATLAB программа была адаптирована от используемой в 18. Авторами были поддержаны Бостонского университета и Массачусетского Life Sciences Center.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
- Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M., Adams, J. A., Ikura, M., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).
- Kerr, R. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , (2006).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875 (2009).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
- Rand, J. B. Acetylcholine. WormBook. , (2005).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS ONE. 8 (1), e53419 (2013).
- Byrne, A. B., Edwards, T. J., Hammarlund, M. In vivo Laser Axotomy in C. elegans. J. Vis. Exp. (51), e2707 (2011).
- Kerr, R., Lev-Ram, V., Baird, G., Vincent, P., Tsien, R. Y., Schafer, W. R. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4, 727-731 (2007).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans. Lab. Chip. 7, 1515-1523 (2007).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27, 7586-7596 (2007).
- Pinan-Lucarre, B., Gabel, C. V., Reina, C. P., Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Slone, R. D., Xue, J., Qiao, Y., Weisberg, S., Roodhouse, K., et al. The Core Apoptotic Executioner Proteins CED-3 and CED-4 Promote Initiation of Neuronal Regeneration in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 10, e1001331 (2012).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30 (2006).
- Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10554-10559 (2004).
- Kindt, K. S., Quast, K. B., Giles, A. C., De, S., Hendrey, D., Nicastro, I., Rankin, C. H., Schafer, W. R. Dopamine mediates context-dependent modulation of sensory plasticity in C. elegans. Neuron. 55, 662-676 (2007).
- Chalasani, S. H., Chronis, N., Tsunozaki, M., Gray, J. M., Ramot, D., Goodman, M. B., Bargmann, C. I. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nature. 450, 63-70 (2007).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. J. Neurosci. 27, 6083-6090 (2007).
- Biron, D., Shibuya, M., Gabel, C., Wasserman, S. M., Clark, D. A., Brown, A., Sengupta, P., Samuel, A. D. A diacylglycerol kinase modulates long-term thermotactic behavioral plasticity in C. elegans. Nat. Neurosci. 9, 1499-1505 (2006).
- Ghosh-Roy, A., Wu, Z. L., Goncharov, A., Jin, Y. S., Chisholm, A. D. Calcium and Cyclic AMP Promote Axonal Regeneration in Caenorhabditis elegans and Require DLK-1 Kinase. Journal of Neuroscience. 30, 3175-3183 (2010).
- Bianchi, L., Gerstbrein, B., Frokjaer-Jensen, C., Royal, D. C., Mukherjee, G., Royal, M. A., Xue, J., Schafer, W. R., Driscoll, M. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nat. Neurosci. 7, 1337-1344 (2004).
