C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans
Summary
작은 투명 몸, 잘 문서화 neuroanatomy 및 의무 유전자 기술과 시약의 호스트로,<em> C. elegans</em>를위한 이상적인 모델 유기체를 만들어<em> 생체 내</em상대적으로 단순하고 저렴한 비용으로 기술을 사용하여> neuronal 영상. 여기 유전자 인코딩 형광 칼슘 지표를 사용하여 그대로 어른이 동물에서 단일 신경 세포 이미징을 설명합니다.
Abstract
선충류 웜 C. elegans는 생체에서 상대적으로 단순하고 저렴한 비용으로 neuronal 이미징을위한 이상적인 모델 생물이다. 작은 투명 몸과 간단한 잘 특징 신경계의 손상 동물에서 확인하고 신경 세포의 형광 이미징 할 수 있습니다. 동물의 생리 기능에 미치는 영향을 최소화와 간단한 고정 기법은 오랜 시간 경과 영상 할 수 있습니다. 이러한 cameleon 1 GCaMP이 같은 유전자 인코딩 칼슘 민감한 fluorophores의 개발은 세포 생리학과 neuronal 활동을 모두 관련된 neuronal 칼슘의 생체 이미징에 수 있습니다. 특정 뉴런에서 이러한 fluorophores을 표현 수많은 유전자 변형 종자는 쉽게 사용할 수 있습니다 또는 잘 구축 된 기술을 사용하여 구축 할 수 있습니다. 여기, 우리는 GCaMP와 cameleon를 사용하여 생체 내에서 단일 신경 세포 내 칼슘 역학을 측정하기위한 세부 절차를 설명합니다. 우리는 장점과 disadvant을 논의모두 세뿐만 아니라 샘플 준비 (동물 고정) 및 이미지 분석의 다양한 방법. 외상성 레이저 손상 신경의 생리적 칼슘 응답을 측정 cameleon를 사용하여 외부 전기 분야 2 특정 뉴런의 감각 반응)를 측정하는 GCaMP를 사용하여 : 1) 마지막으로, 우리는 두 실험의 결과를 제시한다. 다음과 같은 칼슘 이미징 기술은 C.에 광범위하게 사용됩니다 elegans와는 유전 적 배경에서 자유롭게 이동하는 동물, 동시에 여러 뉴런과 비교 측정으로 확장되었습니다. C.는 elegans 기술 단순성과 비용의 다른 모델 시스템을 통해 장점과 생체 neuronal 이미지에 대한 강력하고 유연한 시스템을 제공합니다.
Introduction
여기 C.의 생체 칼슘 이미징에 대한 실질적인 방법을 제시 elegans의 뉴런. 높은 신호 대 잡음 비율 유전자 인코딩 칼슘에 민감한 fluorophores의 개발은 C.하게 neurophysiology과 활동의 측정을위한 비교적 간단하고 비용 효율적인 시스템을 elegans. 우리 이미징는 일반적으로 사용 가능한 fluorophores의 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 표준 복합 현미경으로 이루어집니다. 우리는 각각의 강점과 약점을 토론, 다양한 fluorophores 서로 다른 샘플 준비를 채용 몇 가지 기술을 제시한다. 데이터는 후 두 예를 들어 실험에서 제공됩니다. 여기에서 설명한 기술에 훌륭한 추가 리소스가 WormBook, "영상 뉴런과 근육의 활동"R. 커로 (에서 찾을 수 있습니다 http://www.wormbook.org ) 3.
geneti의 두 가지 주요 클래스켈리 인코딩 형광 칼슘 기자는 일반적으로 C.에 사용됩니다 elegans : 단일 채널 GCaMP과 걱정 기반 cameleon. 우리는 방법을 설명하고 각에서 생성 된 데이터에 대한 예를 표시합니다.
GCaMP는 주변 칼슘 농도에 민감 수정 그린 형광 단백질 (GFP)을 기반으로합니다. 이것은 calmodulin에 의해 칼슘의 바인딩이 효율적으로 형광등 확인이로 GFP 분자을 제공되도록 GFP의 융합과 높은 칼슘 친 화성 단백질 calmodulin에 의해 달성된다. 이 fluorophores의 최근 발전은 칼슘 수준의 생리적 범위와 ~ 95 밀리 초 상승 시간 및 ~ 650 밀리 초 감소 시간 4 합리적으로 빠른 반응 속도론 이상의 형광 강도의 최대 500 % 증가로 뛰어난 신호 크기를 생성합니다. 비교적 짧은 기간 (분) 동안이 대형 신호는 낮은 해상도 영상을 허용 (낮은 배율)와, 잘 행동 INIT 부여 할 수 있습니다ial 기준 측정, 연속 기준선 또는 비교 측정의 필요성을 깨뜨릴.
Cameleon은 두 개의 독립적 인 채널이나 파장 1 비교 ratiometric 측정을 생성하는 걱정 기반의 형광가되는 장점이 있습니다. 이 calmodulin 단백질로 연결 두 개의 별도 fluorophores (시안과 노란색 발광 형광 단백질, CFP 및 YFP)으로 구성되어 있습니다. 단지는 CFP을 자극 푸른 빛 (440 nm 정도)으로 조명하고 있습니다. 칼슘의 바인딩은 YFP (수용체)에 CFP (기증자)에서 형광 공명 에너지 전송 (걱정) 증가와 CFP 방사 (480 nm 정도)가 감소하고 YFP 방사 (535 nm 정도) 증가하는 원인이 서로 가깝게 fluorophores을 제공합니다 . 상대 칼슘 수준은 YFP / CFP 강도의 비율로 측정됩니다. Cameleon의 동력학은 ~ 1 초의 상승 시간과 ~ 3 초 5 붕괴 시간을 가지고 생체로 측정 GCaMP,보다 느린 있습니다. 그러나,oppositely 이동 신호의 비율은 신호의 크기를 증가시키고 인해 형광 농도, 모션 또는 초점 드리프트 및 표백의 변화에 가능한 유물의 번호를 보상.
유전자 인코딩 형광 기자 exogenously 관리 프로브와 C.와 함께 필요한 샘플 준비의 대부분을 백지화 elegans 작은 투명한 몸은 간단한 넓은 필드 형광을 사용하여 손상 동물에서 이미지 할 수 있습니다. 샘플 준비의 주요 기술 과제는 안전하게 동물을 고정하는 것이 있습니다. 다른 일반적으로 사용되는 기술 장점과 단점 각각의 숫자가 있습니다. 동물을 마비하는 약리 에이전트를 사용하면 쉽게 구현할 수 있으며, 수 (Levamisole, 점유 근육 조직을 일으키는 일반적으로 6 데 사용되는 cholinergic 작용제) 한 준비에서 여러 동물의 장착. C. elegans는 물리적으로 장착하여 고정 할 수 있습니다뻣뻣한 10% 아가로 오스 7, 8 있습니다. 동물의 생리 기능에이 최소화 미치는 영향은 장기 이미징 (시간) 여러 동물의 복구를 할 수 있지만 더 기술적으로 어렵습니다. 이러한 기술 모두 동물 (이는 커버 슬립 이하)에 물리적으로 액세스를 제한하기 때문에 특정 실험 자극 (예 : 빛, 온도, 전기장 또는 레이저 손상 등)와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 화학 물질의 접촉이나 관리와 같은 물리적 인 액세스가 필요합니다 자극에 대한 많은 연구가 성공적으로 C.이 붙은 것 장소에 elegans (수의학 등급 접착제를 사용하여) 9. 이 기술적으로 더 도전이며, 하나의 동물 준비하고 동물 복구를 허용하지 않습니다. 마지막으로, 다수의 마이크로 유체 장치는 물리적 C.을 억제하는 고용 한 elegans은, 동물 생리를 보존 자극 (장치 설계에 따라 다름) 대부분의 유형에 대한 노출을 허용하고하면 동물의 신속한 교류 및 복구를 사용할 수 있습니다 <sup> 10, 11. 그러나 microfluidics는 디자인, 제조 및 구현에 추가 기술 기술과 기능을 필요로합니다. 고정 동물 활동 및 자극에 반응은 일반적으로 감각과 interneurons로 측정 할 수 있습니다. 모터 뉴런의 활동 움직이는 동물의 이미지에 대한 더 많은 정교한 기술을 필요로합니다. 여기 약리 paralyzation와 치열한 아가로 오스와 고정의 두 가장 간단한 기술을 채용 자세한 방법을 제시합니다.
여기에 제시된 방법은 C.의 neuronal 활동 및 세포 생리학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다 elegans. 우리는 각각의 예를 들어 주 : 외부 전기장에 ASJ 신경의 감각 응답을 측정 할 수 GCaMP 사용하고, 신경 세포의 레이저 손상 생리 칼슘 응답을 측정 cameleon을 사용합니다. 이러한 예는 fluorophores의 두 유형의 장점과 단점을 보여 시스템이 가능합니다 무엇을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 인코딩 칼슘 표시기가 널리 C.에 활용 된 elegans 신경 생물학. 많은 그룹은 전기 필드에 ASJ 응답과 함께 시연와 같은 외부 자극에 차 감각 뉴런의 반응을 공부하고 이러한 기술을 고용하고 있습니다. 눈에 잘 띄는 예는 기계 터치의 감각, 특정 화학 물질, 온도 및 전기 분야 12, 16-19 등이 있습니다. interneuron 및 근육 세포의 활동은 자극에 대한 응답으로, 동물 행동의 통제?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
몇몇 사람들은이 문서에 설명 된 작업에 기여 하였다. CVG는 실험 설정을 구축하고, LS, SHC, 그리고 CVG는 실험을 수행했습니다. CVG와 SHC는 원고를 썼다. 모든 저자는 이후 개정 과정에 참여했고 원고의 최종 사본을 승인했습니다. 우리는 GCaMP 변형에 대한 폴 Sternberg 감사드립니다. 이 작품에 사용 된 일부 선충류의 긴장은 연구 자원에 대한 NIH 국립 센터 (NCRR)의 지원을 받고 있습니다 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에 의해 제공되었다. MATLAB 이미지 분석 프로그램은 18에서 사용되는에서 적응되었습니다. 저자는 보스턴 대학과 매사추세츠 생명 과학 센터에서 지원했다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse Ti-U inverted microscope |
Nikon | ||
| Intensilight HG Illuminator | Nikon | C-HGFI | Fluorescent light source |
| CFI Plan Apo VC 60X Oil | Nikon | ||
| Optical table or 3’X3′ optical grade breadboard |
Thor Labs | If an optical table is not used an optical grade breadboard on a solid laboratory bench should suffice. |
|
| Clara Interline Camera | Andor Technology |
High-sensitivity CCD camera | |
| wtGFP Longpass Emission | Chroma Technology Corp. |
41015 | GFP filter set for imaging GCaMP |
| Filter 440 +/- 10 nm | Chroma | D440/20x EX | excitation filter for cameleon |
| Dichroic mirror > 455 nm longpass |
Chroma | 455DCLP BS | microscope dichroic for cameleon imaging |
| Dichroic mirror > 515 nm longpass |
Chroma | 515DCLP BS | dichroic mirror for cameleon imaging |
| Filter 535 +/- 15 nm | Chroma | D535/30m EM | YFP emission filter |
| Filter 480 +/- 20 nm | Chroma | D485/40m EM | CFP emission filter |
| Lens, 200 mm, Achromat | Thor Labs | AC508-200-A1 | Relay lens for FRET optics (3) |
| Silver broadband mirror | Thor Labs | ME2S-P01 | FRET optics (2) |
| NGM buffer | |||
| Levamisole | Sigma | ||
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 08691-10, 2.5% by volume, 50 nm diameter |
polystyrene nanoparticles for C. elegans immobilization |
| Transgenic strain, Strain gpa-9::GCaMP3(in pha-1; him-5 bkg) |
Sternberg Lab | Strain PS6388 | |
| Transgenic strain, mec- 4::YC3.60 |
Gabel Lab | Strain CG1B |
References
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