Разделение<em> Plasmodium тропической</em> Поздняя стадия-инфицированных эритроцитов магнитных средств
Summary
Парамагнитные свойства hemozoin используются для изоляции поздних стадиях<em> Plasmodium тропической</em>-Инфицированных красных кровяных клеток, растущих в культуре. Метод прост и быстр и не влияют на последующие инвазивным возможности паразитов.
Abstract
В отличие от других видов Plasmodium, P. тропической можно культивировать в лабораторных условиях, что облегчает его изучение 1. В то время как паразитемии достигнуты может достигать ≈ 40% предел, следователь обычно держит доля составляет около 10%. Во многих случаях это необходимо изолировать паразита содержащих красных кровяных телец (эритроцитов) из незараженных, чтобы обогатить культуру и продолжить данный эксперимент.
Когда P. тропической поражает эритроциты, паразит деградирует и питается от 2 гемоглобина, 3. Тем не менее, паразиты должны иметь дело с очень токсичным железосодержащего гема часть 4, 5. Паразит ускользает от его токсичность путем преобразования гема в инертного полимера кристалл называется haemozoin 6, 7. Это железосодержащих молекулы хранятся в его пищу вакуоли и металл в нем имеет окислительное состояние, которое отличается от той, в гем 8. Трехвалентного состояния железа в гемozoin придает ей парамагнитных свойств отсутствует в неинфицированных эритроцитов. Как вторжение паразита достигает зрелости, содержание haemozoin также увеличивает 9, который дарит еще больше парамагнетизма на последних стадиях P. тропической внутри эритроцитов.
Основываясь на этом парамагнитных свойств, последние этапы P. тропической инфицированной-красные клетки крови могут быть разделены путем передачи культуры через колонку, содержащую магнитные шарики. Эти шарики стали магнитные когда столбцы, содержащие их, размещенных на магнитный держатель. Зараженные эритроциты, из-за их парамагнетизма, затем будет в ловушке внутри колонны, в то время как проточные будет содержать, по большей части, неинфицированных эритроцитов и те, которые содержат ранних стадий паразита.
Здесь мы описываем методологию для обогащения населения конце паразитов сцене с магнитной колонны, которая поддерживает хорошие жизнеспособности паразитов 10.После выполнения этой процедуры, одинокие культуры может быть возвращен в инкубатор, чтобы остальные паразиты продолжают расти.
Protocol
Representative Results
Discussion
В пробирке культуру паразита малярии P. тропической обладают ограниченным паразитемии, причем более половины из красных кровяных клеток неинфицированных на самом высоком распространение точка культуре. Для большинства исследовательских экспериментов, желательно, чтобы ра?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась грантом PRB-009 для CS и докторские стипендии для LC, от Secretaría Насьональ де Ciencia у Tecnología (SENACYT), Панама.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 Hepes Modified | Sigma-Aldrich | R4130 | Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
| LS Columns | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
| Hemacytometer | Grafco | Grafco Neubauer Chamber | Can be found through many other suppliers |
References
- Jensen, J. B., Trager, W. Plasmodium falciparum in culture: use of outdated erythrocytes and description of the candle jar method. J. Parasitology. 63 (5), 883-886 (1977).
- Guzman, I. Y., Francis, S. E., Oksman, A., Smith, C. E., Duffin, K. L., Goldberg, D. E. Order and specificity of the Plasmodium falciparum hemoglobin degradation pathway. J. Clin. Invest. 93, 1602-1608 (1994).
- Rosenthal, P. J., Meshnick, S. R. Hemoglobin catabolism and iron utilization by malaria parasites. Mol. Biochem. Parasitol. 83 (2), 131-139 (1996).
- Fitch, C. D., Chevli, R., Kanjananggulpan, P., Dutta, P., Chevli, K., Chou, A. C. Intracellular ferriprotoporphyrin IX is a lytic agent. Blood. 62 (6), 1165-1168 (1983).
- Hebbel, R. P., Eaton, J. W. Pathobiology of heme interaction with the erythrocyte membrane. Semin. Hematol. 26 (2), 136-149 (1989).
- Egan, T. J. Haemozoin formation. Mol. Biochem. Parasitol. 157 (2), 127-136 (2008).
- Hempelmann, E., Marques, H. M. Analysis of malaria pigment from Plasmodium falciparum. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 32 (1), 25-30 (1994).
- Fitch, C. D., Kanjananggulpan, P. The state of ferriprotoporphyrin IX in malaria pigment. J. Biol. Chem. 262 (32), 15552-15555 (1987).
- Moore, L. R., Fujioka, H., Williams, P. S., Chalmers, J. J., Grimberg, B., Zimmerman, P. A., Zborowski, M. Hemoglobin degradation in malaria-infected erythrocytes determined from live cell magnetophoresis. FASEB J. 20 (6), 747-749 (2006).
- Spadafora, C., Gerena, L., Kopydlowski, K. M. Comparison of the in vitro invasive capabilities of Plasmodium falciparum schizonts isolated by Percoll gradient or using magnetic based separation. Malaria J. 10, 96 (2011).
- Jackson, K. E., Spielmann, T., Hanssen, E., Adisa, A., Separovic, F., Dixon, M. W., Trenholme, K. R., Hawthorne, P. L., Gardiner, D. L., Gilberger, T., Tilley, L. Selective permeabilization of the host cell membrane of Plasmodium falciparum-infected red blood cells with streptolysin O and equinatoxin II. Biochem. J. 403, 167-175 (2007).
- Goodyer, I. D., Johnson, J., Eisenthal, R., Hayes, D. J. Purification of mature-stage Plasmodium falciparum by gelatine flotation. Ann. Trop. Med. Parasitol. 88 (2), 209-211 (1994).
- Pasvol, G., Wilson, R. J., Smalley, M. E., Brown, J. Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. Ann. Trop. Med. Parasitol. 72, 87-88 (1978).
- Pertoft, H. Fractionation of cells and subcellular particles with Percoll. J. Biochem. Biophys. Methods. 44 (1-2), 1-30 (2000).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. The Lancet. 318, 70-71 (1981).
- Trang, D. T., Huy, N. T., Kariu, T., Tajima, K., Kamei, K. One-step concentration of malarial parasite-infected red blood cells and removal of contaminating white blood cells. Malar. J. 3, 7 (2004).
- Nillni, E. A., Londner, M. V., Spira, D. T. A simple method for separation of uninfected erythrocytes from those infected with Plasmodium berghei and for isolation of artificially released parasites. Z. Parasitenkd. 64, 279-284 (1981).
