Summary

Trennung<em> Plasmodium falciparum</em> Late Stage-infizierten Erythrozyten durch magnetische Mittel

Published: March 02, 2013
doi:

Summary

Die paramagnetischen Eigenschaften des Hämozoins werden verwendet, um späten Stadien der Isolierung<em> Plasmodium falciparum</em> Infiziert rote Blutkörperchen wachsen in der Kultur. Die Methode ist einfach und schnell und hat keinen Einfluss auf die nachfolgenden invasiven Fähigkeiten der Parasiten.

Abstract

Im Gegensatz zu anderen Plasmodium-Arten, P. falciparum kann im Labor, die ihre Studie 1 erleichtert kultiviert werden. Während die Parasitämie erreicht die ≈ 40%-Grenze erreichen kann, die Ermittler in der Regel hält der Anteil bei rund 10%. In vielen Fällen ist es notwendig, die Parasiten-haltigen roten Blutkörperchen (Erythrozyten) von den infizierten diejenigen, zu isolieren, um die Kultur zu bereichern und fahren Sie mit einem gegebenen Experiment.

Wenn P. falciparum infiziert den Erythrozyten, verschlechtert sich die Parasiten und speist von Hämoglobin 2, 3. Allerdings muss der Parasit mit einem sehr giftig eisenhaltigen Häm-Einheit 4, 5 umzugehen. Der Parasit entzieht seiner Toxizität durch die Umwandlung der Häm in einem inerten Kristall Polymer namens haemozoin 6, 7. Diese eisenhaltigen Molekül in seiner Nahrungsvakuole gespeichert und das Metall in sich hat einen oxidativen Zustand, der sich von dem in Häm 8 unterscheidet. Die Eisen-III von Eisen in der Häm-ozoin verleiht es eine paramagnetische Eigenschaft fehlt in infizierten Erythrozyten. Da die eindringenden Parasiten Reife erreicht, der Inhalt haemozoin erhöht auch 9, die noch Paramagnetismus schenkt den letzten Stadien von P. falciparum Inneren der Erythrozyten.

Basierend auf dieser paramagnetische Eigenschaft, die neuesten Stadien von P. falciparum infizierten Erythrozyten-Zellen können durch Passieren der Kultur über eine Säule mit magnetischen Kügelchen abgetrennt werden. Diese Perlen werden magnetisch, wenn die Spalten enthält sie auf einem Magnethalter gestellt werden. Infizierten Erythrozyten, die aufgrund ihrer Paramagnetismus, werden dann im Inneren der Säule eingefangen werden, während die Flow-Through enthält, zum größten Teil nicht infizierten Erythrozyten und solchen mit frühen Stadien des Parasiten.

Hier beschreiben wir die Methodik, um die Bevölkerung der späten Phase Parasiten mit magnetischen Säulen, die gute Parasiten Lebensfähigkeit 10 hält bereichern.Nach Durchführung dieses Verfahrens kann das ungebundene Kultur in einen Inkubator zurückgegeben werden, damit die verbleibenden Parasiten weiter wachsen.

Protocol

Alle Schritte des Protokolls, mit Ausnahme Zentrifugationen, sollte innerhalb einer Haube zu halten die Probe steril erfolgen. Ein. Late Stage Isolierung von P. falciparum-infizierten Erythrozyten Alle späten Stadien von Plasmodium-infizierten Erythrozyten kann mit dieser Methode getrennt werden, da Hemozoin, die Paramagnetismus überträgt der Parasit, ist eine gemeinsame Metabolit zur Gattung. Eine hohe Parasitämie (3-10%) in der Kultur wird empfohlen,…

Representative Results

In Abbildung 2 wird das Kulturmedium durch den magnetischen Spalte gezeigt, vor (A) und nach dem Verfahren (B). Ein bis zwei infizierten Erythrozyten werden in der Regel auf einem 100-facher Vergrößerung Feld gesehen, wie in 2 gezeigt, wobei die Pfeile zeigen auf infizierten Erythrozyten in 2A. In einem typischen Verfahren, beginnend mit einem Kulturmedium mit 5% Parasitämie (2A), die Leistung dieses Verfahrens erzeu…

Discussion

In-vitro-Kulturen des Malaria-Parasiten P. falciparum Parasitämie weisen eine begrenzte, mit mehr als der Hälfte der nicht infizierten Erythrozyten auf dem höchsten Punkt der Proliferation Kultur. Für die meisten Forschungs-Experimenten ist es wünschenswert, dass es nur mit den infizierten Erythrozyten. Zu diesem Zweck ist ein Trennverfahren notwendig, die Kultur nach der Infektion zu unterteilen. Nützliche Verfahren umfassen die Verwendung von Streptolysin O zu permeabilisieren und lysieren die …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde gefördert durch Gewährung PRB-009 CS und ein Promotionsstipendium an LC, aus dem Secretaría Nacional de für Wissenschaft und Technologie (SENACYT), Panama.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
RPMI 1640 Hepes Modified Sigma-Aldrich R4130 Supplemented with 10% human serum, 2% glucose, and 0.2% sodium bicarbonate
MidiMACS Separator MACS Miltenyi BioTec 130-042-302
MACS MultiStand MACS Miltenyi BioTec 130-042-303
LS Columns MACS Miltenyi BioTec 130-042-401
Hemacytometer Grafco Grafco Neubauer Chamber Can be found through many other suppliers

References

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Cite This Article
Coronado, L. M., Tayler, N. M., Correa, R., Giovani, R. M., Spadafora, C. Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means. J. Vis. Exp. (73), e50342, doi:10.3791/50342 (2013).

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