В естественных условиях измерения мышь легочных эндотелиальных поверхностного слоя
Summary
Эндотелиальных гликокаликса / эндотелиальных поверхностного слоя идеально изучены с помощью прижизненной микроскопии. Прижизненная микроскопия является технически сложной задачей в движущемся органа, такие как легкое. Мы показываем, как одновременный светлое и флуоресцентной микроскопии может быть использована для оценки эндотелиальной толщину поверхностного слоя в свободно движущихся<em> В естественных условиях</em> Мышь легких.
Abstract
Эндотелиальных гликокаликса представляет собой слой протеогликанов и гликозаминогликанов, связанных выстилающих просвет сосудов. В естественных условиях, гликокаликса очень увлажненной, формирование существенных эндотелия поверхностного слоя (ESL), что способствует поддержанию функции эндотелия. Как эндотелиальных гликокаликса часто аберрантной в пробирке и теряется при стандартных методов фиксации тканей, изучение ESL требует использования прижизненной микроскопии. Чтобы максимально приближают комплекса физиологии альвеолярного микрососудов, легочной прижизненных изображений идеально выполнены на свободно движущихся легких. Эти препараты, однако, как правило, страдают от обширного артефактов движения. Мы показываем, как закрытые груди прижизненной микроскопии свободно движущихся мышей легких может быть использован для измерения гликокаликса целостности через ESL исключения флуоресцентно-меченных декстранов высоким молекулярным весом от эндотелиальной поверхности. Это без рекуперации хирургическая техника, которая требуетодновременное светлое и флуоресцентных изображений мыши легких, позволяет продольные наблюдения субплеврально микрососудов без признаков вызывая смешанные повреждения легких.
Introduction
Эндотелиальных гликокаликса является внеклеточный слой протеогликанов и гликозаминогликанов, связанных выстилающих сосудистую интиму. В естественных условиях, гликокаликса сильно увлажненной, формирование существенных эндотелия поверхностного слоя (ESL), который регулирует различные эндотелиальной функции, включая жидкости проницаемости 1, нейтрофилов-эндотелиальной адгезия 2, а механотрансдукции жидкости сдвига 3 стрессом.
Исторически сложилось, что гликокаликса был недооцененным из-за его отклонение от нормы в культуре клеточные препараты 4, 5 и его деградации во время стандартной фиксации тканей и обработки 6. Увеличение использования 7 прижизненной микроскопии (в естественных условиях микроскопии, IVM) совпал с повышенным научный интерес к важности ESL на сосудистую функцию при здоровьем и болезнью. ESL является невидимым для световой микроскопии и не могут быть легко помечать вестественных условиях, учитывая склонность люминесцентных гликокаликса-связывающие лектины вызывают РБК агглютинации 8 и фатальной легочной эмболии (неопубликованные данные). Некоторые косвенные подходы Поэтому были разработаны вывести ESL толщины (и, как следствие, гликокаликса целостности) в неподвижных сосудистого русла, такие как cremasteric и брыжеечных microcirculations. Эти методы включают в себя измерение различий в скорости циркулирующих микрочастиц как функция расстояния от эндотелиальной мембраны (микрочастицы Измерение скорости Изображения 9), а также измерение исключения громоздких, флуоресцентно-меченных сосудистых маркеров (например, декстраны) от поверхности эндотелиальных (декстран исключения техники 10, 11). Из этих методов, только декстрана исключения способны оценить ESL толщиной от измерений в одной точке во времени. По одновременного измерения ширины сосудистого использованием светлого микроскопии (ширина винклюзивного из "невидимых" ESL) и флуоресцентной микроскопии сосудистой трассирующими исключены из ESL, ESL Толщина может быть рассчитана как половина разницы между сосудистыми шириной 2.
Использование мгновенного мера толщины ESL хорошо подходит для исследования легочной гликокаликса. Прижизненные микроскопии легких является сложной задачей, учитывая значительный легочной и сердечной движения артефакт. Хотя последние достижения позволяют для иммобилизации мыши легких в 12 естественных, 13, существует обеспокоенность относительно физиологического воздействия легких застой. Легкое неподвижности связано со снижением эндотелиальной окиси азота сигнализации, 14 сигнального пути, что влияет как на адгезию нейтрофилов 15 и повреждения легких 16. Кроме того, иммобилизация области легких подвергает окружающих альвеолы для мобильных вредные поперечных сил (так называемый "atelectrauma"), в соответствии с классическими физиологическими понятиямиальвеолярной взаимозависимости 17.
В 2008 году Арата Tabuchi, Вольфганг Kuebler и его коллеги разработали хирургическая техника позволяет прижизненной микроскопии свободно движущихся мышей легких 18. Респираторные артефактов, связанных с этой техникой может быть сведено на нет использование высокоскоростной обработки изображений, в том числе одновременное измерение светлое и люминесцентной микроскопии. В этом отчете мы подробно описывается как мгновенное исключение декстрана визуализации может быть использован для измерения толщины ESL в субплеврально микроциркуляцию свободно двигаться, в естественных условиях мышь легких. Этот метод может быть легко изменена, чтобы определить гликокаликса функции-в частности, способностью нетронутой ESL, чтобы исключить элементы из циркулирующих эндотелиальных поверхности. Мы недавно эти методы использовались для определения важности легочной целостности ESL в развитии острого повреждения легких при системных воспалительных заболеваний, таких как сепсис 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Одновременно с расширением использования в естественных условиях микроскопии, растет понимание как для существенного размера ESL, а также его большой вклад в сосудистую функцию. Эти новые данные, однако, в основном получены в результате исследований системной сосудистой системы. ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Арата Tabuchi и Вольфганг Kuebler (Университет Торонто) для обучения по прижизненной микроскопии. Мы благодарим Эндрю Кэхилл (Nikon Instruments) за помощь в разработке и осуществлении микроскопии. Эта работа финансировалась NIH / NHLBI гранты P30 HL101295 и K08 HL105538 (для EPS).
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
- Negrini, D., Tenstad, O., Passi, A., Wiig, H. Differential degradation of matrix proteoglycans and edema development in rabbit lung. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 290, L470-L477 (2006).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nat. Med. 18, 1217-1223 (2012).
- Florian, J. A., et al. Heparan sulfate proteoglycan is a mechanosensor on endothelial cells. Circ. Res. 93, e136-e142 (2003).
- Chappell, D., et al. The Glycocalyx of the Human Umbilical Vein Endothelial Cell: An Impressive Structure Ex Vivo but Not in Culture. Circulation Research. 104, 1313-1317 (2009).
- Potter, D. R., Damiano, E. R. The hydrodynamically relevant endothelial cell glycocalyx observed in vivo is absent in vitro. Circ. Res. 102, 770-776 (2008).
- Weinbaum, S., Tarbell, J. M., Damiano, E. R. The Structure and Function of the Endothelial Glycocalyx Layer. Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 121-167 (2007).
- Pittet, M., Weissleder, R. Intravital Imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Kilpatrick, D. C., Graham, C., Urbaniak, S. J., Jeffree, C. E., Allen, A. K. A comparison of tomato (Lycopersicon esculentum) lectin with its deglycosylated derivative. Biochem. J. 220, 843-847 (1984).
- Smith, M. L., Long, D. S., Damiano, E. R., Ley, K. Near-wall micro-PIV reveals a hydrodynamically relevant endothelial surface layer in venules in vivo. Biophys. J. 85, 637-645 (2003).
- Vink, H., Duling, B. R. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circ. Res. 79, 581-589 (1996).
- Marechal, X., et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 29, 572-576 (2008).
- Presson, R. G., et al. Two-Photon Imaging within the Murine Thorax without Respiratory and Cardiac Motion Artifact. The American Journal of Pathology. 179, 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Meth. 8, 91-96 (2011).
- Pearse, D. B., Wagner, E. M., Permutt, S. Effect of ventilation on vascular permeability and cyclic nucleotide concentrations in ischemic sheep lungs. J. Appl. Physiol. 86, 123-132 (1999).
- Hossain, M., Qadri, S., Liu, L. Inhibition of nitric oxide synthesis enhances leukocyte rolling and adhesion in human microvasculature. Journal of Inflammation. 9, 28 (2012).
- Schmidt, E. P., et al. Soluble guanylyl cyclase contributes to ventilator-induced lung injury in mice. AJP – Lung Cellular and Molecular Physiology. 295, L1056-L1065 (2008).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. J. Appl. Physiol. 28, 596-608 (1970).
- Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J. Appl. Physiol. 104, 338-346 (2008).
- Gattinoni, L., Protti, A., Caironi, P., Carlesso, E. Ventilator-induced lung injury: the anatomical and physiological framework. Crit. Care Med. 38, 539-548 (2010).
- Tabuchi, A., Kim, M., Semple, J. W., Kuebler, W. M. Acute Lung Injury Causes Pendelluft Between Adjacent Alveoli In Vivo. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 183, A2490 (2011).
- Roebuck, K. A., Finnegan, A. Regulation of intercellular adhesion molecule-1 (CD54) gene expression. J. Leukoc. Biol. 66, 876-888 (1999).
