マウス肺内皮表面層の in vivo測定における
Summary
内皮グリコカリックス/内皮表面層は、理想的には生体顕微鏡を用いて研究されています。生体顕微鏡検査は、肺などの臓器に移動技術的に困難である。私たちは、同時明視野と蛍光顕微鏡を自由に移動させる際に内皮表面層の厚さを推定するために使用することができる方法を示してい<em生体内で></em>マウス肺。
Abstract
内皮グリコカリックスは、血管の内腔を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの層である。 生体内では 、グリコカリックスは、内皮機能の維持に寄与する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、高度に水和される。内皮グリコカリックスはしばしばin vitroでの異常であり、標準的な組織固定技術の間に失われているように、ESLの研究では、生体顕微鏡を使用する必要があります。肺胞毛細血管の最良近似複雑な生理機能に、肺の生体内イメージングは、理想的には自由に動いて肺に実行されます。これらの製剤は、しかし、一般的に大規模なモーションアーチファクト苦しむ。我々は自由に動いてマウス肺の開胸生体顕微鏡が内皮表面から蛍光標識された高分子量デキストランのESLの除外を介して糖衣の整合性を測定するために用いることができる方法を示しています。必要な場合に、この非回復手術手技、同時明視野とマウス肺の蛍光イメージングは、交絡肺損傷を誘発する証拠がなく胸膜下の微小血管系の長期的観察が可能になります。
Introduction
内皮グリコカリックスは、血管内膜を裏打ちするプロテオグリカンおよび関連するグリコサミノグリカンの細胞外の層です。 生体内では、グリコカリックスは、高度に水和され、流体透過性1を含む内皮様々な機能を調節する実質的な内皮表面層（ESL）を形成し、好中球の内皮接着2、および流体せん断応力3のメカノ。
歴史的に、グリコカリックスは、標準的な組織固定し、処理6時に培養された細胞調製4,5、およびその分解に起因し、そのaberranceに過小評価されています。増加は生体顕微鏡の7（ 生体顕微鏡検査で 、IVM）を使用し、健康と病気の間に血管機能にESLの重要性の高まり科学的関心と一致した。 ESLは、光学顕微鏡には見えませんし、簡単にラベルを付けることができません赤血球凝集8と致命的な肺塞栓（未発表の観察）を引き起こす蛍光グリコカリックス結合レクチンの性癖与えられたin vivoで、。いくつかの間接的なアプローチは、したがって、そのような精巣挙筋および腸間膜microcirculationsとして非移動血管床にESLの厚さ（と、拡張による、グリコカリックスの整合性）を推定するために開発されている。これらの技術は、内皮細胞膜（微粒子画像流速9）と同様に内皮表面からかさばる、蛍光標識された血管マーカー（ 例えばデキストラン）の排除の測定からの距離の関数として微粒子速度を循環さの違いの測定を含む（デキストラン除外手法10、11）。これらの技術のうち、デキストラン除外とは、ある一時点で測定した値からESLの厚さを推定することができる。同時に明視野顕微鏡（の幅を使用して血管の幅を測定することにより、"見えない" ESL）とESLから除外血管トレーサーの蛍光顕微鏡のclusive、ESLの厚さは、血管幅2間の半分の差として計算することができます。
ESLの厚さの瞬間的な尺度の使用は肺糖衣の研究に適しています。肺の生体顕微鏡検査は重要な肺と心臓の動きのアーチファクト与えられ、やりがいがあります。最近の進歩は 、in vivo 12、13 にマウス肺の固定化を可能にしているが、懸念は、肺うっ血の生理学的影響について存在する。肺の不動は14のシグナリング減少内皮一酸化窒素、好中球の接着15と肺損傷16の両方に影響を与えるシグナル伝達経路に関連付けられています。さらに、肺の面積の固定化は、古典的な生理学的な概念による有害なせん断力（ "atelectraumaいわゆる"）にモバイル胞を取り巻く公開肺胞の相互依存17。
2008年、磯崎田淵、ヴォルフガング·キューブラーらが自由に動いてマウス肺18の生体内顕微鏡を可能にする手術法を開発しました。この手法から生じる呼吸アーティファクトは明と蛍光顕微鏡の同時測定など、高速イメージングの使用によって否定することができます。瞬時デキストラン除外イメージングは、生体内で 、自由に行動しているマウス肺の胸膜下微小循環のESLの厚さを測定するために用いることができる方法このレポートでは、我々は詳細。この手法は、簡単に、糖衣機能特異内皮表面から循環要素を除外するために無傷ESLの能力を決定するように変更できます。我々は最近、敗血症2などの全身性炎症性疾患時の急性肺損傷の発展に肺ESLの保全の重要性を決定するためにこれらの技術を使用している。
Protocol
Representative Results
Discussion
生体顕微鏡検査での利用拡大と一致し、ESLの実質的な大きさだけでなく、血管機能への多くの貢献の両方の増加感謝があります。これらの新たなデータは、しかし、主に全身の血管系の研究から派生しています。確かに、肺で生体顕微鏡での使用は重大な肺と心臓の動きのアーチファクトを考えると、技術的に困難である。
最近のいくつかの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は博士に感謝します。生体顕微鏡に関する命令のアラタ田淵とWolfgangキュブラー（トロント大学）。私たちは、顕微鏡の設計と実装を支援するためのアンドリュー·ケーヒル（ニコンインスツルメンツ）に感謝。この作品は、NIH / NHLBI助成P30 HL101295とK08 HL105538（EPSまで）によって賄われていた。
Materials
| Name of Reagent | |||
| FITC-dextran (150 kDa) | Sigma | FD150S | |
| TRITC-dextran (150 kDa) | Sigma | T1287 | |
| Streptavidin-coated fluorescent microspheres | Bangs Laboratories | CP01F/10428 | Dragon Green fluorescence (similar to FITC) |
| Ketamine | Moore Medical | ||
| Xylazine | Moore Medical | ||
| Anti-ICAM-1 biotinylated antibody | eBioscience | Clone YN1/1.7.4 | 1:50 dilution |
| Isotype biotinylated antibody | eBioscience | IgG2b eB149/10H5 | 1:50 dilution |
| EQUIPMENT | |||
| Mechanical ventilator | Harvard Apparatus | Inspira | |
| Tracheostomy catheter | Harvard Apparatus | 730028 | |
| Electrocautery apparatus | DRE Medical | Valleylab SSE-2L | |
| Bipolar cautery forceps | Olsen Medical | 10-1200I | 9.9cm McPherson |
| Temperature control system | World Precision Instruments | ATC1000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | Pump 11 Elite | |
| Microscope (widefield) | Nikon | LV-150 | |
| Microscope (confocal) | Nikon | A1R | |
| Image splitter | Photometrics | DV2 | |
| CCD camera | Photometrics | CoolSNAP HQ2 | |
| Image processing software | Nikon | NIS Elements | |
| Polyvinylidene membrane | Kure Wrap | ||
| Circular cover slip | Bellco | 5CIR-1-BEL | 5 mm, #1 thickness |
| Glue (cover slip to membrane) | Pattex | Flussig (liquid) | For affixing cover slip to membrane |
| Glue (cover slip to mouse) | Pattex | Gel | For attaching membrane to mouse |
| Surgical tubing | Intramedic | PE50, PE10 | |
| Suture | Fisher | 4:0 silk | |
| Electric razor | Oster | 78997 | |
| Curved surgical forceps | Roboz | ||
| Straight surgical forceps | Roboz | ||
| Surgical scissors | Roboz | ||
| Surgical microscissors | Roboz | ||
| Surgical needle driver | Roboz | ||
| Surgical tape | Fisher | ||
| Kitchen sponges (cut into wedges) | various |
References
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