Summary

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.

Abstract

Inzicht in de cel fysiologie van neurale circuits die complexe gedrag reguleren sterk verbeterd door modelsystemen waarop dit kan worden gewerkt in een intact preparaat hersenen waar de neurale circuits van het CZS blijft intact. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch zijn gelabeld met groen fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte hersenen. Vissen hebben meerdere populaties van GnRH neuronen en hun functies zijn afhankelijk van de plaats binnen de hersenen en GnRH gen dat ze expressie 1. We hebben onze demonstratie gericht op GnRH3 neuronen in de terminal zenuwen (TN) van het te reukbollen met de intacte hersenen van transgene vis medaka (Figuur 1B en C). Studies suggereren dat medaka TN-GnRH3 neuronen zijn neuromodulatory, als een zender van informatie uit de externe omgeving aan het centrale zenuwstelsel; they niet een directe rol spelen in het reguleren hypofyse-gonadale functies, net als de bekende hypothalamus GnRH1 neuronen 2, 3. De tonic patroon van spontane actiepotentiaal afvuren van TN-GnRH3 neuronen is een intrinsieke eigenschap 4-6, de frequentie waarvan wordt gemoduleerd door visuele signalen van soortgenoten 2 en het neuropeptide kisspeptin 1 5. In deze video, gebruiken we een stabiele lijn van transgene medaka waarin TN-GnRH3 neuronen drukken een transgenbevattende de promotor regio van Gnrh3 gekoppeld aan verbeterde groen fluorescerend eiwit 7 te laten zien hoe je neuronen identificeren en controleren hun elektrische activiteit in de gehele hersenen voorbereiding 6.

Protocol

1. Dissectie van Brains uit Adult Medaka Verdoven volwassen mannelijke of vrouwelijke (figuur 1A) door onderdompeling in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), en wacht een paar minuten na de kieuwen bewegingen voordat onthoofden hebben opgehouden. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië-Los Angeles. Onthoofden de vis in zoutoplossing bij het staarteinde van de operculum met schaar 60 mm petrischaal. …

Representative Results

Een voorbeeld van bilaterale clusters van GFP-gemerkte TN-GnRH3 neuronen in de hersenen uitgesneden van medaka vissen zijn getoond in figuren 1B en 1C. Elke cluster bevat ongeveer 8-10 GnRH neuronen. De spontane neuronale activiteiten van de doelgroep TN-GnRH3 werden opgenomen in de huidige-clamp-modus (I = 0) met typische werkingsveld van 0.5-6 Hz. Het patroon van de actiepotentiaal afvuren is typisch een tonic of kloppend patroon, met een vrij regelmatige interspike interval. Voorbeel…

Discussion

GnRH 3: GFP transgene vissen bieden unieke modellen om de neurofysiologische mechanismen die ten grondslag liggen aan de neuronale integratie-en regelgeving in het centrale controle van gedragingen die direct en indirect betrokken zijn bij de voortplanting 3, 8-10 bestuderen. Een van de belangrijke voordelen van dit modelsysteem is dat veel GnRH3 neuronen die GFP dicht bij het ​​ventrale oppervlak van de hersenen, waardoor relatief gemakkelijke toegang tot de neuronen voor elektrofysiologische op…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr Meng-Chin Lin en mevrouw Yuan Dong voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health HD053767 (onderaanneming te NLW), en door fondsen van de afdeling Fysiologie en Bureau van de vice-kanselier voor Research, Universiteit van Californië-Los Angeles (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

References

  1. Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
  2. Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
  3. Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
  4. Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
  5. Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
  6. Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
  7. Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
  8. Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
  9. Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
  10. Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
  11. Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
  12. Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
  13. Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).

Play Video

Cite This Article
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

View Video