Gefügig Mammalian Cell Infektionen mit Protozoen-grundiert Bakterien
Summary
Diese Technik stellt ein Verfahren zu ernten, normalisieren und zu quantifizieren intrazellulären Wachstum bakterieller Pathogene, die in natürlichen Protozoon-Wirtszellen vorkultiviert vor Infektionen von Säugerzellen. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um eine große Vielzahl von Wirtszellen für das Priming Bühne sowie Zielzelltypen unterzubringen.
Abstract
Viele intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger verwenden Süßwasser Protozoen als natürliches Reservoir für die Proliferation in der Umwelt. Legionella pneumophila, der Erreger der Legionärskrankheit Lungenentzündung, gewinnt eine pathogene Vorteil gegenüber in vitro kultivierten Bakterien beim ersten von Protozoen Zellen geerntet vor der Infektion von Säugetieren Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass wichtige Virulenzfaktoren möglicherweise nicht richtig in vitro exprimiert werden. Wir haben eine tractable System zur Grundierung L. entwickelt pneumophila durch seine natürliche Protozoen Host Acanthamoeba castellanii vor Säugetierzellen Infektion. Der Beitrag eines Virulenzfaktor durch Vergleichen intrazellulären Wachstum eines Mutantenstammes zu Wildtyp-Bakterien nach Protozoen Priming untersucht werden. GFP-exprimierenden Wildtyp und Mutante L. pneumophila-Stämme verwendet werden, um Protozoen Monoschichten in einem Priming-Schritt infizieren und dürfen späten Stadien der intrazellulären Wachstum zu erreichen. Fluoreszierende Bakterien werden dann aus diesen infizierten Zellen geerntet und normiert durch Spektrophotometrie um vergleichbare Anzahl von Bakterien für eine nachfolgende Infektion in Säugern Makrophagen erzeugen. Zur Quantifizierung werden lebenden Bakterien nach der Infektion überwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie, Durchflusszytometrie, durch Kolonie und Plattieren. Diese Technik hebt und stützt sich auf den Beitrag der Wirtszelle-abhängige Genexpression durch Nachahmung der Umgebung, die in einem natürlichen Erwerb Weg begegnet wäre. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um jegliche Bakterium, das einen Vermittler Host verwendet als Mittel zur Gewinnung eines pathogenen Vorteil unterzubringen.
Introduction
Zahlreiche bakterielle Krankheitserreger allgemeine Strategien zur Wirtszellen für das Überleben und Replikation in einem intrazellulären Kompartiment nutzen angepasst. In vielen Fällen sind pathogenen Mechanismen ähnlich zwischen Protozoen und Metazoen Zellen. Jedoch sind diese beiden Mikroumgebungen sehr verschieden sein und in unterschiedliche Expression von Virulenzfaktoren 1-4 führen. Die Legionärskrankheit Bakterium Legionella pneumophila ist ubiquitär mit Süßwasser-Umgebungen weltweit 5 verbunden. Wichtig ist, dass L. pneumophila in Protozoen Zellen vor der Infektion von menschlichen Monozyten gewinnen eine pathogene Vorteil kultiviert, was darauf hindeutet, dass globale Genexpressionsprofile des Bakteriums Verlassen eines Protozoen-Zelle unterschiedlich sind als die der in vitro kultivierten Organismus 6-8. In der Natur, bieten Süßwasser Amöben nährstoffreichen Grenzen für eine schnelle Verstärkung eines eindringenden Bakteriums. Menschliche Akquisition von L. pneumophila wird häufig die Inhalation von kontaminiertem Wasser Tröpfchen, die das Bakterium enthalten, zurückzuführen. Es ist wahrscheinlich, dass diese Tröpfchen Hafen Protozoen Zell-assoziierten Bakterien, wo Protozoen Zellen sind resistent gegen herkömmliche Wasseraufbereitung Praktiken 9,10. Infektion der Lunge Alveolarmakrophagen verläuft in einer Weise nahezu identisch mit dem intrazellulären Lebenszyklus des Bakteriums in Protozoon-Wirtszellen 11-13.
Um zu überleben und zu replizieren in eukaryotischen Zellen, L. pneumophila verwendet eine spezielle Art IVb Sekretionssystem bezeichnet Dot / Icm auf fast 300 "Effektor"-Proteine in das Zytosol der Wirtszelle 14-16 liefern. Diese Effektorproteine kollektiv funktionieren, um zelluläre Prozesse zu unterlaufen, um eine Replikation permissiv Abteil für das Bakterium 17,18 erzeugen. Deletionen in einem der 26 Gene, die die Dot / Icm Transporters defekt Ergebnis in Stämmen für intrazelluläre mult umfasseniplication 19-23. Historisch Löschen einzelner Effektor-Gene kodieren selten führte Stämme gedämpft für die intrazelluläre Wachstum. Dieses Phänomen hat mehrere Hypothesen, einschließlich redundanter Funktion und paraloge Kopien von Effektoren zugeschrieben.
Einige Virulenzfaktoren sind nur im Rahmen der Wirtszell-assoziierter intrazelluläre Wachstum 24 exprimiert. Wir nahmen an, dass, wenn eine bestimmte Effektorzellen wurde nur im Kontext von Protozoen-Infektion exprimiert wird, dann der Beitrag des Effektors nicht durch einen Wildtypstamm, wenn sowohl in vitro kultiviert wurden verglichen werden. L. pneumophila Übergänge von einem replikativen zu einer transmissiven Phase, wie sie der stationären Phase in der Kultur 25 eintritt. Die Phase Switching Phänotyp stellt die Nährstoffverarmung während der intrazellulären Wachstums gestoßen und wird durch die Montage von Flagellen für Motilität 26 veranschaulicht. Da L. pneumophila ist invasive und virulent, wenn sie von Protozoen Zellen geerntet, haben wir versucht, einen Test, dass mehr treu die pathogenen Zustand des Bakteriums vertreten, wenn es Host-Makrophagen begegnet entwickeln.
Zu diesem Zweck haben wir ein vielseitiges Protozoen Priming-Assay, die jeden geeigneten Wirt für sowohl den ersten (Priming Zelle) und zweiten (Zielzelle) Stufe Infektionen unterbringen kann. Die Infektion Prozess ist lenkbar durch Verwendung von Bakterien stabil exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP). Die Infektion Modell für die Protozoen Acanthamoeba castellanii folgt eine Methode weit verbreitet im Bereich 27 verwendet. Für die Grundierung Schritt, L. pneumophila-Stämme werden in vitro bis zur stationären Phase in flüssigen Medien kultiviert, um als 'durchlässigen' Bakterien (1A) zu erzeugen. Bakterien nächsten zur Monolagen A. infizieren castellanii 18 Stunden zur Erzielung einer späten Stufe des intrazellulären Lebenszyklus. Große Vakuolenten Bakterien können zu diesem Zeitpunkt mittels Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1A) visualisiert werden. Protozoischen Zellen werden dann lysiert und Bakterien aus dem Lysat gewonnen werden für die Emission bei 512 nm unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät gemessen. Fluoreszenz wird mit optischen Dichte korreliert Multiplizität-of-Infektion (MOI) für die Infektion von Zielzellen (Abb. 1, * Korrelation Kurve) zu berechnen. Nach Invasion (T 0) und 18 Stunden nach der Invasion (T 18), werden die Zielzellen für Fluoreszenz quantifiziert darstellt intrazellulären Bakterien. Fluoreszenz kann durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie überwacht werden, und kann durch Keimzahlen Kolonie Plattieren gemessen werden. Die Grundierzusammensetzung Assay wird immer durch Infektionen mit Wildtyp L. begleitet pneumophila und ein Stamm einen Defekt im Dot / Icm Typ IV-Sekretionssystem (Δ dota) (Abbildung 1A). Dies wichtiger bietet interne Kontrollen für direkte Vergleiche zwischen Wildtyp-and keine isogenen Mutanten bei der Infektion verwendet. Die Einbeziehung des avirulenten Stamm Δ DOTA während des Priming Stufe einen Schwellenwert für die Beobachtung eines abgeschwächten Wachstums Phänotypen mit isogenen Mutantenstämmen, die in vitro kultiviert werden, zugeordnet ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakterielle Genexpression dicht durch eine Kombination von Lebenszyklus Progression und ansprechend auf Signale in der umgebenden Mikroumgebung gesteuert. Vacuolar Krankheitserreger wie L. pneumophila zu einer Vielzahl von Host-Zellen abgeleiteten Signale reagiert, wenn in einem Phagosom kompartimentiert. Als Ergebnis der kollektiven Erschöpfung Nährstoff in der Wirtszelle, kompensiert das Bakterium durch Expression für erfolgreiche Verbreitung erforderlich zu einer nachfolgenden 25 Wirtszelle. <e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Craig Roy und Dr. Dario Zamboni für die Bereitstellung einer Vorlage für Protozoen Zelle Infektionen. Wir danken Dr. Jagdeep Obhrai, Dr. Georgiana Purdy, Dr. Fred Heffron und Todd Wisner für Geräte und Reagenzien; Dr. Lulu Cambronne für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Durchflusszytometrie wurde am OHSU Durchflusszytometrie Shared Resource Facility durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus dem Medical Research Foundation of Oregon und einer NIH R21 AI088275 (EDC) unterstützt.
Materials
| Reagent | |||
| chloramphenicol | Fisher Scientific | BP904-100 | antibiotic |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| ACES | Sigma | A9758-1KG | media component |
| ATCC medium: 712 PYG | ATCC | growth media for protozoans | |
| 1X PBS | Fisher Scientific | SH30256FS | phosphate buffered saline |
| activated charcoal | Fisher Scientific | C272-212 | media component |
| yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | media component |
| peptone | BD Diagnostics | 211677 | media component |
| agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | media component |
| L-cysteine, 99%+ | Acros organics | 173601000 | media supplement |
| Ferric nitrate nonahydrate | Fisher Scientific | I110-100 | media supplement |
| Equipment | |||
| EVOS fl | AMG | EVOS fl | fluorescence microscope |
| Smart Spec Plus | Bio-Rad | 170-2525 | spectrophotometer |
| 5810 R centrifuge | Eppendorf | 22627023 | bench top centrifuge |
| Repeater plus | Eppendorf | 22230201 | repeating pipette |
| SpectraMax Gemini EM | Molecular Devices | microplate reader | |
| Softmax Pro 5.3 | Molecular Devices | 0200-310 | microplate reader software |
| 5424 microfuge | Eppendorf | 22620401 | table top microcentrifuge |
| Fast-release pipette pump II | Scienceware | 379111010 | pipette aid |
| FACS Calibur | BD Bioscience | flow cytometer | |
| FlowJo 7.6.1 | FlowJo | license | flow cytometery software |
| 15 ml tube | BD Falcon | 352096 | polypropylene conical tube |
| 1.6 ml microfuge tube | Neptune | 3745.X | microcentrifuge tubes |
References
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